抗癫痫肽重组腺伴病毒载体的构建及鉴定

目的为了研究蝎毒癫痫肽对癫痫模型的治疗作用,构建并产生重组腺伴病毒(AAV)载体。方法将AEP外源性核酸片段插入AAV-shufer质粒pSSHG-Neo的KpnI-BamH I位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒pFG140、包装质粒pAAV/Ad及构建的pSSHG-AEP三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎293细胞系中同源重组包装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果成功构建了重组病毒质粒pSSHG/AEP,经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分,梯度稀释测得滴度为1.46×1012PFU/mL。结论成功地制备了AEP重组腺伴随病毒(rAAV/AEP)载体,为癫痫基因治疗实验奠定了基础。

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的:构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法:使用互补引物/模板法及T载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4-Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果:经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽Exendin-4 cDNA克隆,得到高滴度(2.5×109pfu·L-1)的重组腺相关病毒。结论:通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG/NT4-Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。