腺嘌呤核苷酸转位酶:生理功能及在疾病发生中的病理意义

腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)对线粒体完整性和生物能量代谢至关重要。ANT有4种异构体,生理情况下ANT主要参与膜两侧的腺嘌呤核苷二磷酸/腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine diphosphate/adenosine triphosphate,ADP/ATP)交换,可能是构成线粒体渗透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的主要成分,并参与细胞凋亡和质子泄漏过程。ANT损伤引起线粒体功能障碍,在代谢性疾病、心肌病及肿瘤发生进展中有着重要的病理意义,文章总结了近几年有关ANT的研究进展和知识,旨在为靶向ANT的疾病治疗提供新思路。

腺嘌呤核苷酸转位酶与细胞凋亡

腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)是位于线粒体内膜上的一类转运蛋白,既能将细胞的产能和耗能过程耦联起来,也与线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore MPTP)密切相关,MPTP是位于线粒体内外膜之间的多蛋白组成的高导离子通道,它的开放可诱导细胞凋亡。所以ANT是一种能量转运和凋亡诱导的双重功能蛋白。本文主要就其与细胞凋亡的关系做一综述。

高浓度氧对早产大鼠肺组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1表达的影响

目的探讨高浓度氧暴露对早产大鼠肺组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1(ND1)表达的影响。方法早产SD新生大鼠生后1 d随机分为高氧组和空气组,高氧组持续暴露于≥85%氧气中,空气组置于同一室内常压空气中。分别取两组大鼠高氧或空气暴露后1、4、7、10和14 d肺组织标本,采用免疫组织化学和Western blot方法检测ND1蛋白的表达,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ND1 mRNA的表达。结果①高氧组和空气组各时间点均有ND1蛋白表达;与空气组相比,高氧组在1、4和7 d ND1蛋白表达增高,随后其表达下降。②与同时间点空气组相比,高氧暴露后1、4和7 d ND1 mRNA表达显著增高(P<0.05),其后ND1 mRNA表达逐渐下降,10 d和14d时低于空气组,但两者相比差异无显著性意义(P>0.05)。③ND1蛋白的表达变化趋势与ND1 mRNA的表达变化趋势一致。结论高氧导致早产大鼠肺组织ND1表达改变,提示ND1可能参与了高氧肺损伤的病理生理过程。

具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶功能的家蚕l(3)neo18基因的克隆与表达特征

果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分析了基因结构与表达谱。Bm-l(3)neo18基因(EU826676)的cDNA全长为868 bp,由573 bp的完整开放读码框(ORF)序列、25 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和251 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码蛋白质为190个氨基酸残基,分子质量22.7 kD,pI 9.60。Bm-l(3)neo18基因由3个外显子和2个内含子组成,定位于家蚕第3染色体,位于nscaf2930的1 203.8-1 205.6 knt。Bm-l(3)neo18蛋白质在1-185氨基酸残基位置为ND的SGDH亚基保守区,在61-83氨基酸残基位置具有一个保守的跨膜区域。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(3)neo18与埃及伊蚊等昆虫ND具有50%以上的蛋白质同源性,ND的保守区域高度一致,NJ法分子进化分析也显示Bm-l(3)neo18与昆虫ND进化上同源。该基因除在家蚕卵期的表达量较低外,在幼虫、蛹和蛾期均有较高表达,且存在组织差异性。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1基因重组真核表达质粒的构建及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建含人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1(NOX1)基因重组真核表达质粒,探讨其对血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库查找NOX1基因的mRNA序列,针对蛋白质编码区(CDS)设计引物,以人c DNA为模板扩增出NOX1基因全长CDS序列,经双酶切鉴定后,将NOX1基因与真核表达载体pc DNA3.1(+)连接,再经双酶切、测序鉴定。运用脂质体转染重组体pc DNA3.1(+)-NOX1至VSMC中,观察NOX1表达及VSMC凋亡情况。结果重组体中NOX1基因片段和载体DNA大小与预期一致。经BLAST(the basic local alignment search tool)比对,与NCBI数据库中的NOX1基因序列具有高度的同源性。pc DNA3.1(+)-NOX1能促进VSMC中NOX1蛋白高表达,并促使VSMC的凋亡。结论 NOX1基因重组真核表达质粒能促使VSMC凋亡,为阐明NOX1在主动脉夹层中的作用及分子机制研究奠定了基础。

幽门螺杆菌重组空泡细胞毒素A片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1基因表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(HP)重组空泡细胞毒素A(VacA)片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1(ANT1)基因表达的影响。方法HPVacA基因片段重组质粒转染AGS细胞后,分别于0、24、48、72 h收集细胞,提取总RNA和总蛋白,应用逆转录聚合酶链式反应和蛋白印迹法检测各时相点ANT1基因的mRNA和蛋白表达变化。结果重组VacA基因片段质粒转染AGS细胞后,ANT1基因mRNA和蛋白表达均随时间呈逐渐升高趋势,各时相点的表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论HP可能通过上调ANT1基因的表达,使线粒体膜通透性改变,引起细胞凋亡。

早产大鼠高氧肺损伤组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶的动态表达及其意义

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1、2、5在早产大鼠高氧肺损伤组织中的动态表达及其意义。方法早产新生大鼠生后1d随机分为高氧和空气组,高氧组持续暴露于850mL/L氧气中,空气组置同一室内常压空气中。分别取二组大鼠高氧或空气暴露后1、4、7、10和14d肺组织标本,采用HE染色观察肺组织形态学改变,采用RT-PCR法在mRNA水平检测NADH脱氢酶亚单位1、2、5的表达。结果1.高氧暴露1、4d,早产大鼠肺组织形态较空气组无明显改变;高氧暴露7、10d,肺组织渐出现小血管充血扩张,肺泡腔内炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡数目减少、结构简单化和囊泡化等改变。2.空气组NADH脱氢酶亚单位1(ND1)和亚单位2(ND2)mRNA的表达随日龄增长渐降低,至7d时最低,随后其表达逐渐增高;空气组NADH脱氢酶亚单位5(ND5)mRNA的表达随日龄增长渐降低,至4d时最低,随后其表达逐渐增高。3.与同时间点空气组相比,高氧暴露后1、4和7dND1和ND5mRNA表达显著增强(Pa<0.05),随后其表达渐下降,10、14d时低于空气组,但二者相比差异无显著性意义(Pa>0.05);与同时间点空气组相比,高氧暴露后1、4d ND2 mRNA表达二组间差异无显著性意义(Pa>0.05),7d时较空气组极显著增强(P<0.01),10、14d时较空气组显著降低(Pa<0.05)。结论高氧可导致早产大鼠肺组织NADH脱氢酶表达改变,提示其可能参与高氧肺损伤的病理生理过程。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶染色法术中快速诊断婴幼儿先天性巨结肠的价值

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)酶组织化学染色法在术中快速诊断婴幼儿先天性巨结肠的价值。方法选取2015年1月至2017年3月新疆乌鲁木齐儿童医院收治的37例先天性巨结肠患儿术中切除的肠管为观察标本,以同期因坏死性小肠结肠炎行结肠造瘘术患儿的切除肠管标本作为实验对照,将先天性巨结肠患儿的肠管标本分为扩张段和痉挛段,进行常规冰冻连续切片,采用NADPH-d进行染色(NADPH-染色组),显微镜下观察神经丛及神经节细胞的染色情况,并与术中快速苏木精-伊红(HE)染色法(HE染色组)进行配对比较。结果 37例患儿中,NADPH-d染色诊断阳性36例(97.3%),阴性6例(2.7%);HE染色诊断阳性34例(91.9%),阴性3例(8.1%);2种染色方法均诊断阳性或阴性者分别为34例、1例,另2例NADPH-d染色诊断阳性者HE染色诊断为阴性;2种染色方法的诊断结果比较差异无统计学意义(χ~2=0.059,P>0.05)。NADPH-d染色组扩张段标本低倍镜下可见呈串珠状分布的神经丛样结构,高倍镜下可见细胞质着紫蓝色、细胞核空白无着色的细胞,HE复染显示串珠状分布的紫蓝色组织为肌间神经丛,黏膜下未见着紫蓝色的神经丛;高倍镜下可清楚分辨核大、深染、细胞质略呈蓝色的神经节细胞。NADPH-d染色组痉挛段标本镜下背景清晰,无任何着色,未见神经丛及神经节细胞。HE染色组扩张段标本肌间神经丛内隐约可见神经节细胞,痉挛段肌间及黏膜下可见分布杂乱的神经丛,其间无神经节细胞。结论 NADPH-d染色法诊断婴幼儿先天性巨结肠快速、精确、易操作,NADPH-d法与术中快速HE染色法联用能提高诊断效率,准确判断病变段肠管的切除范围。

基于计算机模拟探究鱼类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶源活性肽抗运动疲劳的功效

为了研究鱼类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase,NADH Dehydrogenase)源活性肽抗运动疲劳的功效,该研究利用计算机模拟水解5种我国常见鱼类中的NADH Dehydrogenase蛋白亚基,将模拟水解得到的寡肽与乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)分别进行分子对接,确定与LDH和CK具有超高亲和力的寡肽(对接分数≤-160),并利用Pymol、Ligplot+软件分析寡肽与LDH和CK分子间相互作用机制。结果显示,5种鱼类的7种不同NADH Dehydrogenase蛋白亚基经计算机模拟水解和分子对接后共获得72个超高亲和力寡肽,其中,与LDH、CK均具有超高亲和力的寡肽共36种,对接分数最高且出现次数最多的寡肽是PTIW(-198.762、-204.400)。研究结果为提升鱼类蛋白质的高值化利用以及开发抗疲劳功能食品提供理论参考。

二化性家蚕滞育发动期间滞育性卵和非滞育性卵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化

为了探究家蚕滞育发动期间呼吸耗氧量下降与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量变化的关系,用高效液相色谱法和分光光度法分别检测在25℃条件下产下后12～72 h的二化性家蚕滞育性卵与非滞育性卵中的还原型NAD(NADH)含量、氧化型NAD(NAD+)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。滞育性卵中的NADH+NAD+含量、NADH/NAD+值及LDH活性分别在产下后18、36、24 h达到峰值,而cMDH活性处于波动中。在产下后24～72 h,非滞育性卵中的NADH/NAD+值极显著低于滞育性卵,而LDH和cMDH活性极显著高于滞育性卵。据此可以推测,滞育发动期间家蚕滞育性卵的NAD+降解增强和NAD+再生下降共同导致呼吸耗氧量下降。

嘌呤核苷酸减弱吗啡抑制的PC12细胞嘌呤核苷酸合成代谢

目的:探讨外源性嘌呤核苷酸对吗啡致神经细胞核苷酸合成代谢降低的影响。方法:大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)分为对照组、吗啡组、单嘌呤核苷酸(AMP+GMP)组、三嘌呤核苷酸(ATP+GTP)组、吗啡+AMP+GMP组及吗啡+ATP+GTP组。应用RT-PCR法检测各实验组腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因转录产物含量的变化。结果:吗啡组AK mRNA及HGPRT mRNA表达量(分别为1.330±0.108和1.407±0.141)与对照组(1.874±0.161和1.923±0.155)比较明显降低(P<0.01,P<0.05)。吗啡+AMP+GMP组AK mRNA表达量(1.626±0.171)与吗啡组和对照组比较差异无显著性(P>0.05),HGPRT mRNA表达量(1.796±0.168)高于吗啡组(P<0.05)。吗啡+ATP+GTP组AK mRNA表达量(1.107±0.164)低于对照组(P<0.01),HGPRT mRNA表达量(1.563±0.209)与吗啡组及对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论:外源性补充嘌呤核苷酸能改善吗啡所致的PC12细胞嘌呤核苷酸合成代谢关键酶基因表达降低。

高浓度氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸表达的影响

目的探讨高浓度氧(高氧)暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-脱氢酶亚基4(ND4)表达的影响。方法原代培养早产Sprague-Dawley(SD)大鼠AECⅡ,待其在含50mL/L二氧化碳(CO2)培养箱中生长至接近融合状态时随机分为高氧组和空气组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧中,氧体积分数>900mL/L,CO2体积分数为50mL/L;空气组仍置于含50mL/L CO2培养箱中。二组分别于高氧或空气暴露6、12、24h提取细胞RNA,采取半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定ND4 mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测细胞爬片ND4蛋白的表达。结果与空气组比较,免疫细胞化学结果显示高氧暴露6、12h ND4的表达无显著性差异(Pa>0.05),高氧暴露24h ND4的表达显著减弱(P<0.05);RT-PCR检测显示高氧暴露6h ND4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),高氧暴露12、24h ND4 mRNA表达显著减弱(Pa<0.05)。结论高氧暴露下调早产SD大鼠AECⅡ ND4 mRNA和蛋白水平的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程。

双酶法呈味核苷酸的研制 第2报 高产腺嘌呤核苷酸脱氨酶菌种筛选、酶的形成及其作用条件的研究

酵母 RNA 经 PD 酶降解,产生4种5′—核苷酸,其中5′—AMP 需脱氨后才能转化为具有鲜味的5′—IMP。脱氨作用可用化学方法或者生物化学方法来完成。我们采用生化方法,即从微生物中筛选产 AMP 脱氨酶(简称 AD酶)强的菌种来完成 AMP 到 IMP 的转化过程,同时确定菌种的产酶条件和酶作用条件,尤其要解决与脱氨酶同时存在的磷酸单酯酶作用的问题,以免后者将5′—核苷酸分解为核苷。

丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体表达的影响

目的探讨丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体(ANB)表达的影响。方法选择无特定病原体级的SD大鼠进行析因设计:即LC组(6月龄,无干预对照);LT组(6月龄,丙酸睾酮干预);LS组〔6月龄,5-羟色胺(HT)干预〕;MC组(21月龄,无干预对照);MT组(21月龄,丙酸睾酮干预);MS组(21月龄,5-HT干预);HC组(24月龄,无干预对照);HT组(24月龄,丙酸睾酮干预);HS组(24月龄,5-HT干预),每组8只。干预后,取大鼠脊髓腰骶段,观察ANB和一氧化氮合酶(NOS)的表达。结果 ANB和NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背侧部,随着大鼠的衰老,ANB的表达逐渐增多。丙酸睾酮干预组ANB表达要明显少于对照组。5-HT干预组ANB表达与无干预对照组无明显变化。随着大鼠的衰老,NOS的表达逐渐增少。丙酸睾酮干预组NOS表达要明显多于对照组,5-HT干预组NOS表达与无干预对照组无明显变化。各组脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈负相关。结论脊髓腰骶段ANB的出现与衰老有关,随着机体的老化ANB的表达逐渐增多。脊髓腰骶段ANB的出现可能与体内衰老过程中睾酮的减少存在一定的关系,补充丙酸睾酮可以减少衰老过程中ANB的出现;而补充5-HT则未见类似效果。

腺嘌呤核甘酸转运子-1在大鼠压力超负荷致心肌重塑中的表达

目的:探讨心肌线粒体腺嘌呤核甘酸转运子-1(adeninenucleotidetranslocator-1,ANT1)对压力超负荷致心肌重塑的影响。方法:利用腹主动脉缩窄法建立大鼠压力超负荷模型,假手术组大鼠3只作为对照组。观察时间点为术后1,2,4,7,14,21和30天。ANT1mRNA含量的测定采用RT-PCR法,利用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡。心肌纤维化的改变采用心肌胶原形态定量分析。结果:①与对照组比较,缩窄后4天ANT1mRNA的含量上调,并于第7天达到峰值,术后14天其含量回落至对照组水平,并保持至30天。②手术组心肌细胞凋亡在术后1天即升高,在4天时进入高峰期并持续至7天,其后低水平持续存在,直至实验结束。而对照组未发现凋亡的存在。③与对照组比较,心肌胶原容积分数于术后14天方明显增加,并持续增高。结论:ANT1参与了压力超负荷致心肌重塑早期心肌细胞凋亡的调节,并可能影响了这一过程的发生和发展。

嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响

目的探讨外源性补偿嘌呤核苷酸对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢酶的影响。方法将50只雄性Wis-tar大鼠随机分为对照组、海洛因组、海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组。采用real-timePCR的方法检测大鼠脑皮质中腺苷脱氨酶(ADA)、黄嘌呤氧化酶(XO)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)mRNA的表达水平。结果海洛因组ADA、XO的mRNA比对照组明显升高(P<0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比明显降低(P<0.05)。海洛因组HGPRT、APRT和AK的mRNA比对照组明显降低(P<0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比有不同程度升高,以HGPRT的升高程度尤为显著(P<0.05)。海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组的各项指标差异无显著性。结论海洛因在大鼠基因水平上促进嘌呤核苷酸的分解代谢,降低合成代谢,而补偿嘌呤核苷酸可以抑制或拮抗海洛因的上述作用。

顿抑心肌中腺嘌呤核苷酸转运体基因的动态表达

目的:通过观察大鼠心肌缺血再灌注模型中腺嘌呤核苷酸转运体(adeninenucleotidetranslocator,ANT)的动态表达情况,初步探讨顿抑心肌中ANT各单体的表达变化对心肌能量代谢的影响及其与心肌细胞凋亡的联系。方法:实验于2003-11/2004-04在解放军南京军区南京总医院心脏内科实验室和动物实验中心完成。将60只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=8)和手术组(n=52)。将手术组大鼠冠状动脉左前降支结扎闭塞20min,然后剪断结扎线再灌注。按缺血后再灌注4h、1,3,7d4个时相分4组进行观察(n=13)。用反转录-聚合酶链反应计算机凝胶成像分析系统测定心肌中ANT1,ANT2mRNA相对含量。对照组大鼠不干预。结果:60只大鼠进入结果分析。①ANT1mRNA含量在缺血后再灌注4h达高峰(P<0.05)。在再灌注1d开始降低,再灌注3d时明显下降(P<0.05),逐渐恢复到对照水平(P>0.05),再灌注7d的结果与再灌注3d相似。②ANT2mRNA含量在再灌注4h时无明显增加,在再灌注1d开始升高并达峰值(P<0.01),从再灌注3d开始明显下降(P<0.01),并恢复到对照水平(P>0.05)。再灌注7d结果与再灌注3d相似。结论:①顿抑心肌中ANT的含量增加,顿抑心肌中能量短缺的现象可在缺血后再灌注3d内得以纠正。②心肌缺血可以导致细胞凋亡,心肌细胞凋亡主要发生在缺血再灌注早期(24h内),而且在体内存在时间短暂(缺血后再灌注3d内恢复)。

嘌呤核苷酸对海洛因依赖及戒断大鼠垂体嘌呤核苷酸代谢关键酶基因表达的影响

目的研究嘌呤核苷酸对海洛因依赖及戒断大鼠垂体嘌呤核苷酸分解代谢关键酶腺苷脱氨酶(ADA)、嘌呤核苷酸补救合成关键酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因表达的影响,阐明海洛因对垂体嘌呤核苷酸代谢的损害及嘌呤核苷酸补偿的对抗作用。方法建立海洛因依赖及戒断大鼠模型,80只建模成功的雄性Wistar大鼠随机分成对照组(生理盐水)、核苷酸组(不给海洛因)、海洛因组、海洛因+核苷酸组(同时给药)、海洛因戒断3d组、海洛因戒断9d组、核苷酸3d组(海洛因停药后给核苷酸3d)及核苷酸9d组(海洛因停药后给核苷酸9d)(每组10只)。检测垂体组织内ADA及HGPRT基因表达的情况。结果与对照组比较,海洛因组、戒断3d组大鼠垂体ADA mRNA水平有所增高,但差异均无显著性(P>0.05)。垂体组织核苷酸组HGPRT mRNA水平高于对照组(P<0.05),其他各组与对照组比较,差异均无显著性(P>0.05)。结论海洛因有增强大鼠垂体组织ADA基因表达,减弱HGPRT的基因表达作用,但作用不显著;补偿嘌呤核苷酸保持海洛因依赖大鼠垂体ADA和HGPRT基因表达的相对稳定。