腺病毒介导人肝细胞生长因子对大鼠皮层神经元损伤的保护作用

目的 :探讨腺病毒介导人肝细胞生长因子 (Ad -HGF)对体外无血清培养所致大鼠皮层神经元损伤的保护作用。方法 :用流式细胞仪测定不同感染强度 (MOI)条件下携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒 (Ad GFP) (2 5 ,5 0 ,10 0 ,2 0 0 pfu/cell)对皮层神经元的转染效率 ,确定最佳MOI ;ELISA测定Ad HGF在最佳感染强度下皮层神经元中的表达规律 ;通过中性红染色和PI Hoechst33342双染色法比较转染Ad HGF组与对照组 (转染Ad GFP组和空白对照组 )间无血清培养后 6h、12h、2 4h和 4 8h细胞的存活情况。结果 :在感染强度为 5 0 pfu/cell时 ,重组腺病毒对皮层神经元的转染率达 99.3% ,Ad HGF能在皮层神经元中有效而持久地表达 ,接种后 2h转染Ad HGF组的细胞死亡率和凋亡率在无血清培养后 12h明显低于两对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :Ad HGF对接种后 2h转染组无血清培养所致的损伤有显著的保护作用 ,对接种后第 5d转染的皮层神经元无血清所致的损伤虽亦具有一定的保护作用 ,但不明显。

重组腺病毒介导人肝细胞生长因子在病理性瘢痕基因治疗研究中的应用

采用细胞内质粒DNA同源重组方法,将人肝细胞生长因子基因构建于E1,E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上,获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad—HGF.在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad—HGF和Ad—GFP(携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒),然后,用Ad—GFP和Ad—HGF体外分别转染原代培养的兔耳瘢痕成纤维细胞,观察体外转染效率及表达,并以新西兰兔耳瘢痕为体内模型,观察局部瘢痕组织中一次性注射Ad—HGF后对已形成瘢痕的治疗作用.结果显示:(i)Ad—GFP感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后,3 d时转染效率为(36.8±14.1)％,并持续表达20 d以上.(ii)用ELISA方法检测Ad—HGF感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后HGF的表达,结果感染后3 d表达量约为76 ng/4.0×105细胞.(iii)用兔耳瘢痕模型观察在瘢痕内注射不同剂量(8.6×109,8.6×108,8.6×107,8.6×106pfu)的Ad—HGF,于注射后第32天肉眼可见Ad—HGF治疗组瘢痕较治疗前明显缩小、变薄,甚至与周围皮肤在同一水平.这一效应呈剂量依赖性:大、中剂量组(8.6×109,8.6×108pfu)治疗前后瘢痕肥大指数的减少有统计学意义(P<0.05),尚可见不同程度再生的丛状新生毛,低剂量组(8.6×107,8.6×106pfu)治疗后瘢痕肥大指数有减小但无统计学意义。

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响及机制研究

目的:观察术前注射腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165(Ad-HGF/VEGF165)对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响和其机制的初步研究。方法:大鼠背部设计超比例随意皮瓣模型,将其随机分为Ad-HGF/VEGF165组、AdVEGF165组和对照组。术前7 d,Ad-HGF/VEGF165组和Ad-VEGF165组分别于大鼠皮瓣及创缘内多点注射Ad-HGF/VEGF165及AdVEGF165,对照组注射等容量0.9%氯化钠注射液。分别于术后7 d、14 d观测皮瓣成活面积,切取皮瓣组织标本HE染色、免疫组化观察微血管密度及组织间VEGF阳性率等指标,WesternBlot检测目的蛋白表达情况。结果:术后7 d、14 d,Ad-HGF/VEGF165组、Ad-VEGF165组皮瓣存活面积、组织间微血管数目、VEGF及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达情况均高于对照组(P<0.001),且Ad-HGF/VEGF165组明显高于Ad-VEGF165组(P<0.05)。结论:Ad-HGF/VEGF165具有协同作用,能显著促进VEGF和ERK1/2信号因子表达,短期内促进血管网重建,改善皮瓣血液灌注,提高大鼠超比例随意皮瓣成活面积。

重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠肝纤维化的实验研究

目的:评价携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒对大鼠肝纤维化模型的治疗作用。方法:DMN法建立W istar大鼠肝纤维化模型后,将8.6×109pfu的Ad-HGF经尾静脉注射入大鼠体内,对照组注射同剂量的Ad-GFP。第40天心脏采血,检测血清GPT、GOT、TP和TB il,并取肝组织做HE染色,观察两组大鼠肝脏的病理形态。结果:治疗组部分动物肝功能有所改善,对照组不明显。与对照组相比,治疗组大鼠的肝组织损伤程度较轻,汇管区看不到明显的纤维增生,并可见双核肝细胞和分裂相细胞。结论:腺病毒介导的HGF基因可能有部分治疗大鼠肝纤维化的作用。

腺病毒载体介导的RNAi对胶质瘤U251细胞肝细胞生长因子受体表达的影响

目的探讨腺病毒载体介导的RNA干扰技术对胶质瘤细胞肝细胞生长因子(HGF)受体(c-Met)的表达和细胞凋亡的影响。方法用PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至U251细胞;分别采用RT-PCR和Westernblot方法检测U251细胞的c-MetmRNA和蛋白的表达,Annexin-V-PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况。结果获得了带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了rAdUshmet1和rAdUshmet2的U251细胞的c-MetmRNA和蛋白相对表达量较未转导腺病毒及转导了rAdGFP和rAdU-sicon的U251细胞均有明显下降(P<0.01),rAdUshmet1和rAdUshmet2转导的U251细胞凋亡率分别为(13.5±4.2)%和(28.2±5.6)%,明显高于未转导腺病毒的及rAdGFP和rAdUsicon转导的U251细胞凋亡率(P<0.05)。结论腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c-Met表达,能在一定程度上阻断HGF-c-Met信号通路,有可能成为对胶质瘤进行基因治疗的有效载体。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管内皮细胞的作用

目的:研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管内皮细胞后在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧的情况下细胞的凋亡情况。方法:将分离、培养的内皮细胞分为3组,分别给予M199(对照组)、HGF(HGF组)和HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF组),分别在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧3种情况下观察细胞的凋亡情况。结果:Ad-HGF组及HGF组细胞凋亡数均低于对照组(P<0.01),Ad-HGF组与HGF组细胞凋亡数差异无显著性意义。结论:腺病毒载体介导HGF基因感染内皮细胞后能在缺氧情况下有效地阻止细胞凋亡。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管平滑肌细胞的作用

目的:研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管平滑肌细胞后在缺氧和正常供氧时的细胞凋亡和迁移情况。方法:以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠杆菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序,转染腺病毒,经三轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF),再感染人血管平滑肌细胞(VSMC)为观察组(Ad-HGF组);未感染为阴性对照组(DMEM组);以含人工合成HGF为阳性对照组(HGF组),分别在正常供氧和缺氧情况下观察细胞的凋亡和迁移情况。结果:与DMEM组及HGF组比较,Ad-HGF组在缺氧和正常供氧时VSMC的迁移率及凋亡细胞数差异均无显著性意义。结论:HGF基因感染VSMC后,在缺氧情况下并不促进VSMC的迁移,亦不抑制其凋亡。

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景：肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成，已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗。目的：鉴于重组腺病毒的宿主范围广，探讨重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、目的蛋白表达及细胞活性的影响。设计、时间及地点；2006—08／2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验。材料：清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞。携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠。方法：向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导。以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞。重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞。主要观察指标：油红。染色检测成脂情况。流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达，计算转染效率。ELISA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达，MTT法检测转染脂肪细胞的活性。结果：①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴，成脂率（97-31±0．46）％。②以100pfu／cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72h后，绿色荧光蛋白表达量达高峰，此时转染效率为65．39％。③以100pfu／cell作为最佳感染强度转染脂肪细胞72h后，肝细胞生长因子的表达量为峰值。与未转染空白对照比较，转染后24，48，72，96，168h脂肪细胞活性均无明显变化（t=-0．024～0．092，P〉0．05）。结论：重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞，有效表达目的蛋白，且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对冠状动脉再狭窄的预防作用

目的应用重组腺病毒载体介导的肝细胞生长因子(HGF)基因转染血管内皮细胞(VEC)及血管平滑肌细胞(VSMC),探讨HGF基因对其凋亡的诱导作用。方法以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用RT-PCR技术获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠埃希菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序证实后,转染腺病毒,制造病毒包涵体,经3轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF)。以此感染VEC及VSMC,设为Ad-HGF组;再以人工合成HGF培养VEC及VSMC为阳性对照组(HGF组);以未感染Ad-HGF的细胞为阴性对照(对照组)。并采用流式细胞仪检测缺氧情况下各组细胞的凋亡率。结果VEC的Ad-HGF、HGF组细胞凋亡率均低于对照组,差异均有极显著性意义(均P<0.01),但VSMC的3组细胞凋亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结论腺病毒载体介导HGF基因感染VEC后能在缺氧情况下有效地阻止VEC发生凋亡,但不能有效抑制VSMC凋亡,提示对冠状动脉再狭窄有预防作用。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达。万法:将人源性的VEGF165 cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达。结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610 bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108pfu／ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达。结论:成功构建了表达人VEGF165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础。

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。

肝细胞生长因子基因重组腺病毒修饰间充质干细胞修复急性放射性损伤大鼠的创面

背景:基因药物与干细胞联合应用促进难治性大面积创面修复。目的:观察携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(adenovirus hepatocyte growth factor,Ad-HGF)修饰的间充质干细胞对大鼠皮肤放射性损伤创面促愈合的作用。方法:体外分离、培养雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,转染Ad-HGF后备用。40只雌性Wistar大鼠用X射线局部照射制备急性放射性皮肤损伤模型。并将模型大鼠随机分为单纯间充质干细胞治疗组、单纯Ad-HGF治疗组、Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组、溶剂对照组4组,制备模型即刻各组将相应细胞悬液、病毒悬液及溶剂行创面边缘多点注射。结果与结论:苏木精-伊红染色结果显示,伤后21d Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组再生表皮明显薄于溶剂对照组,并可见丰富的新生小血管,且表皮较单纯间充质干细胞治疗组和单纯Ad-HGF治疗组更平整,新生小血管更丰富;免疫组织化学结果表明,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组创面中肝细胞生长因子表达均强于其他组;羟脯氨酸含量Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组在7d后显著低于其他组(P<0.05);原位杂交结果显示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组修复的皮肤组织中性别决定基因sry表达强于单纯间充质干细胞治疗组。结果提示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞对皮肤放射性损伤创面有显著的促愈合修复作用,且优于二者单独应用。

心腔内注射腺病毒携带肝细胞生长因子转染大鼠急性缺血心肌的实验研究

目的 分析研究腺病毒携带肝细胞生长因子 (Ad -GFP)心腔内注射转染对大鼠缺血心肌的影响。方法 将4 5只Wistar大鼠随机分为心室腔注射Ad -HGF组 (Ⅰ组 ) ,心室腔注射携带绿色荧光蛋白 (Ad -GFP)组 (Ⅱ组 ) ,心室腔注射生理盐水对照组 (Ⅲ组 ) ,各组分别于术后 3,7,14 ,2 1,2 8d各处死 3只进行有关指标的检测。结果 心室腔注射Ad -HGF组术后 3d心脏冷冻切片出现绿色荧光 ,14d消失 ,14 ,2 1,2 8d可见大量的新生血管生成 ,较对照组有明显的增加。结论 心室腔注射Ad -HGF组见微小血管大量生成 。

携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

目的:构建携带人白细胞介素10(hIL-10)和人肝细胞生长因子(hHGF)双基因的重组腺病毒载体。方法:分别以pDC316-hIL10-EGFP和pCDNA3-hHGF重组质粒为模板,PCR扩增获得hIL-10和hHGF基因片段,与pIRES连接成为hIL10-IRES-hHGF,测序正确后酶切,与pDC315连接,获得穿梭质粒pDC315-hIL10-IRES-hHGF,与腺病毒包装系统转染293细胞,包装产生重组腺病毒hIL10-hHGF,PCR鉴定后,扩增病毒,并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL-7402和WRL-68细胞,ELISA法检测上清液中hIL-10和hHGF的含量。结果:成功构建了重组腺病毒hIL10-hHGF,扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染BEL-7402和WRL-68细胞72 h后,表达hIL-10的量分别为(6 271.7±5.2)pg/ml和(350.6±12.4)pg/ml,表达hHGF的量分别为(20 827.1±345.5)pg/ml和(201.6±10.1)pg/ml。结论:本实验为进一步研究Ad-hIL10-hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。

重组腺病毒肝细胞生长因子对乙型肝炎病毒感染滋养层细胞的抑制作用

目的:探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)体外感染滋养层细胞(JEGⅢ)的治疗作用。方法:在转染与不转染rAd-HGF两种情况下,HBV阳性血清感染JEGⅢ。用GIMSA染色、透射电镜及荧光定量PCR三种方法观察感染后细胞形态学及培养物中HBV-DNA含量的变化。结果:形态学观察转染rAd-HGF组细胞病变较未转染组有明显减轻,且未转染组胞质内可见HBV颗粒。荧光定量PCR显示未转染Ad-HGF组培养上清中HBV-DNA含量较转染组明显增高(P<0.05)。结论:HGF可有效抑制HBV感染滋养层细胞。

重组腺病毒介导肝细胞生长因子转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的评价重组腺病毒介导肝细胞生长因子(Ad-HGF)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的转染效率及对干细胞增殖的影响。方法1只雄性Wistar大鼠,鼠龄4周,体质量约90 g。采用密度梯度离心法结合贴壁法分离培养大鼠BMSC,流式细胞仪进行鉴定;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)转染BM-SC,探索最佳感染指数(MOI),激光共聚焦显微镜观察转染效果,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比浊法(MTT)测定转染对BMSC增殖的影响;在最佳MOI时Ad-HGF转染BMSC,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定人HGF在不同时间的表达。结果成功培养大鼠BMSC,GFP成功表达,不影响细胞增殖(P>0.05);转染效率随MOI增大逐渐增加,在MOI=200时,效率达88.42%;Ad-HGF成功高效率转染MSC,HGF基因得到持续高表达,48 h时达最高水平。结论Ad-HGF成功高效率转染大鼠BMSC,外源基因得到持续表达,不影响干细胞活性。

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法,以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切,以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段;将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中,并用限制内切酶鉴别插入方向,得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体,使它们线性化;以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组,构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质,将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装,使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞;经逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外,酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的;绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示。肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功,为血管疾病转基因治疗奠定了基础,具有一定临床价值。