肝移植联合腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦治疗肝细胞癌的研究探索

目的分析肝移植(liver transplantation,LT)联合腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(adenovirus-mediated delivery of herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,ADV-TK/GCV)治疗肝细胞癌的临床疗效,希望能使更多超米兰标准的肝细胞癌患者从中获益。方法收集笔者团队2007年至今采用LT治疗的肝细胞癌患者的临床病理资料,根据是否联合ADV-TK/GCV将患者分为单纯LT组和LT+ADV-TK/GCV组,比较总体肝细胞癌患者及其中超米兰标准患者行单纯LT和LT+ADV-TK/GCV治疗后的5年累积总生存率和无复发生存率,同时采用Cox回归多因素分析影响肝细胞癌患者LT术后长期总生存时间和无复发生存时间的危险因素。结果本研究共收集到符合纳入条件的肝细胞癌患者216例,其中单纯LT组134例、LT+ADV-TK/GCV组82例,单纯LT组和LT+ADV-TK/GCV组累积5年总生存率分别为52.9%和48.5%、累积无复发生存率分别为41.5%和44.5%。216例肝细胞癌患者中超米兰标准患者162例,超米兰标准患者中单纯LT者101例、LT+ADV-TK/GCV者61例。所有肝细胞癌患者和超米兰标准肝细胞癌患者的单纯LT组和LT+ADV-TK/GCV组的基线资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对所有肝细胞癌患者分析的5年总生存率和无复发生存率比较差异均无统计学意义(P>0.05);对超米兰标准肝细胞癌患者的生存分析发现,LT+ADV-TK/GCV患者的5年总生存率优于单纯LT患者(χ^(2)=4.11,P=0.047),但未发现二者的5年无复发生存率比较差异有统计学意义(以27个月生存时间为界,P=0.46、P=0.06)。Cox回归多因素分析影响肝细胞癌患者LT术后总生存率和无复发生存率的危险因素发现,患者的年龄小、累积肿瘤直径大及术前TNM分期晚降低LT术后患者无复发生存概率(P<0.05),而未发现联合ADV-TK/GCV治疗对长期无复发生存率的影响(P>0.05);同时发现累积肿瘤直径越小、术前TNM分期早、术前血清甲胎蛋白≤400μg/L及联合ADV-TK/GCV治疗能提高LT术后患者长期总生存率(P<0.05)。结论从本研究结果看,LT+ADV-TK/GCV治疗能改善超米兰标准肝细胞癌患者LT术后的长期总生存率,从而使更多LT患者从中获益。

腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统联合光动力治疗口腔恶性肿瘤的初步观察

目的应用腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶(ADV-TK)/更昔洛韦(GCV)系统联合光动力疗法对口腔恶性肿瘤复发患者进行治疗,探讨此法治疗口腔恶性肿瘤的临床效果。方法选取10名口腔不同部位的恶性肿瘤复发患者,用光敏剂——血卟啉衍生物(HPD)静脉给药,选择相应激光输出功率定时照射,以ADV-TK基因行瘤体及周边注射,经GCV静脉输入治疗后,通过影像学及瘤体血流动力学分析进行临床疗效评估。结果经联合法治疗后,患者肿瘤明显缩小(甚至完全消失),瘤体内血流量降低,影像结果对比改变明显,治疗效果理想。结论将ADV-TK/GCV系统联合光动力治疗口腔恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤效应,具备副作用轻微、临床安全性高的特点,为系统性治疗相关肿瘤提供了一种安全可靠的治疗手段。

全反式维A酸对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因结合更昔洛韦旁观者效应增强作用及其机制

目的 通过研究全反式维A酸 (ATRA )对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因结合更昔洛韦 (HSV tk/GCV)旁观者效应的增强作用及与Cx4 3表达的关系 ,为提高TK自杀基因的疗效及探索增强作用机制提供实验基础。方法 应用Polybrene转染、荧光定量RT PCR等技术 ,观察ATRA对宫颈癌细胞ME180 ,ME180 /TK转化细胞旁观者效应及诱导Cx4 3mRNA表达的作用。结果 ME180 ,ME180 /TK不同比例的混合细胞随ATRA浓度的增加而存活率降低。ME180 +ME180 /TK混合细胞的存活率随ME180 /TK细胞比例的增加而降低。在 2mg·L- 1更昔洛韦 (GCV)作用下 ,以 10 - 8mol·L- 1ATRA与不加ATRA (0mol·L- 1)的作用相比较 ,在ME180与ME180 /TK不同比例混合的各组中 ,细胞的存活率明显降低 (P <0 .0 5 )。并观察到10 - 8及 10 - 10 mol·L- 1ATRA对GCV旁观者效应的增强作用。RT PCR结果表明 ,经ATRA处理的ME180细胞 ,其Cx4 3mRNA的相对拷贝数比值增高约 1.84倍及 2 .6 5倍。结论 宫颈癌ME180细胞中 ,ATRA在10 - 8～ 10 - 10 mol·L- 1范围内 ,具有明显增强HSV tk/GCV旁观者效应的作用。其主要机制是通过ATRA在转录水平诱导Cx4 3mRNA表达上调 ,导致旁观者效应的增强。

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及更昔洛韦系统对S-D大鼠的毒副作用

旨探讨将单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因载体生产细胞（pLTKcSN／VPC）脑内注射和腹腔注射更昔洛韦（GCV）在大鼠体内的急性系统性毒副作用，以及载体生产细胞（VPC）在大鼠脑内的存在时问。S-D大鼠24只，雌雄各半，随机分为2组。第1组颅内注射pLTKcSN／VPC，细胞总量3ｘ106/只，7天后腹腔注射GCV30mg·kg-1·d-1，共7天。GCV用药结束后1周处死动物，进行备脏器组织学检查及TK序列的聚合酶链反应（PCR）和原位杂交检测。第2组，采用脑内注射等量整合有β半乳糖苷酶基因（β-gal／nVPC），注射后的9、14、21和30天各处死3只动物，取注射针道周围脑组织行冰冻切片x-gal组化染色，观察VPC在大鼠脑内的生存时限。结果：第1组动物的各脏器组织学病理改变主要为脑内手术部位蛛网膜下腔出血、个别动物有心肌间质灶性炎症和肝细胞脂肪变性。TK序列聚合酶链反应（PCR）检测动物体内各脏器均未检出TK序列。x-gal组化染色见9天和21天两个时问点分别有1只动物脑内有阳性细胞存在。本文结果提示：pLTKcSN／VPC及GCV系统对大鼠脑及全身各脏器有轻微非特异性急性毒副作用，pLTKcSN／VPC在大鼠体内的生存时间约为3周。为pLTKCSN／VPC及GCV系统的临床试验治疗恶性脑胶质瘤提供了脑内注射PLTK。SN／VPC的安全性依据。

腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦联合手术治疗艾滋病合并唾液腺恶性肿瘤的初步观察

艾滋病患者免疫功能低下,可发生唾液腺恶性肿瘤，且常难以承受术后放、化疗带来的不良反应[1]。为降低术后高复发率和远处转移率．我们对2008年7月至2014年8月收治的8例唾液腺恶性肿瘤的艾滋病患者．应用腺病毒为载体的单纯疱疹病毒一胸苷激酶（ADV—TK）／更昔洛韦（GCV）系统代替放、化疗，取得初步疗效,报告如下。

逆转录病毒介导的胸苷激酶基因治疗难治性卵巢癌裸鼠模型的观察

目的:运用HSV-TK/GCV系统治疗卵巢癌裸鼠移植肿瘤模型,比较不同治疗方式的疗效。方法:常规培养包装细胞PA317,PA317细胞含有携带HSV-TK基因的逆转录病毒,测定病毒滴度。在移植瘤内多点注射PA317细胞以及浓缩病毒,观察GCV治疗后的肿瘤体积变化,对移植肿瘤进行组织病理分析,PCR检测TK基因在移植肿瘤组织的转导情况。比较两种不同治疗方式的疗效。结果:常规细胞培养上清重组逆转录病毒滴度为6×104cfu/mL;注射PA317细胞后肿瘤生长受到抑制,P<0.05;注射浓缩病毒后肿瘤生长抑制不明显,P>0.05;PCR检测证实TK基因在肿瘤组织中的转导;病理检测见中、重度治疗反应。结论:HSV-TK/GCV系统对人难治性卵巢癌裸鼠移植肿瘤有治疗作用,不同治疗方式疗效不同。

病毒蛋白22增强单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦基因治疗系统杀伤卵巢癌细胞的体内研究

目的 探讨病毒蛋白 2 2 (VP2 2 )的细胞间传递作用 ,以及其促进单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK ) 更昔洛韦 (GCV)基因治疗系统对卵巢癌移植瘤细胞的体内杀伤效应。方法 用慢病毒感染卵巢癌 3AO细胞 ,形成携带HSV TK基因的 3AO细胞 (3AO TK)及携带HSV VP2 2 TK融合基因的3AO细胞 (3AO VP2 2 TK)。分别在裸鼠皮下接种 10 %含卵巢癌 3AO TK(3AO TK组 )或 3AO VP2 2 TK(3AO VP2 2 TK组 )的混合细胞 ,并以接种单纯 3AO细胞裸鼠为对照 (3AO组 ) ,每组裸鼠 10只。当肿瘤体积达 15 0mm3后 ,分别于腹腔注射GCV 10mg kg、5 0mg kg。结果 注射 10mg kgGCV后 ,3AO TK组与 3AO VP2 2 TK组肿瘤体积、重量比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ,3AO VP2 2 TK组肿瘤生长明显受到抑制 ;注射 5 0mg kgGCV后 ,两组肿瘤体积、重量比较 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。注射GCV 10mg kg后 ,3AO TK组肿瘤抑制率为 37 7% ,3AO VP2 2 TK组肿瘤抑制率为 91 5 % ,两组比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;注射GCV 5 0mg kg后 ,3AO TK组肿瘤抑制率为 81 8% ,3AO VP2 2 TK组肿瘤抑制率为 96 7% ,两组比较 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 VP2 2介导的自杀基因产物细胞间扩散作用 ,可明显加强对体内肿瘤细胞的杀伤效应。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和更昔洛韦对膀胱癌细胞的旁观杀伤效应

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV tk)基因和更昔洛韦 (GCV)对膀胱癌细胞的旁观者效应和机制。方法 将转染HSV tk基因的膀胱癌细胞HTB9与HTB9细胞混合培养 ,在GCV作用下 ,观测细胞的存活率。HTB9 tk细胞条件培养基 ,经不同孔径的滤膜过滤 ,将滤液及0 .2 2 μm滤膜上的物质重新加入HTB9细胞 ,观察细胞存活率。结果 当HTB9 tk细胞 50 %时 ,共培养细胞对GCV的敏感性近 1 0 0 %,表明每个表达HSV tk基因的细胞至少杀死 1个不含HSV tk基因的膀胱癌细胞。HTB9 tk细胞的条件培养液过滤后直径大于 0 .2 2 μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用。结论 HSV tk/GCV对膀胱癌细胞具有明显旁观者效应的毒性作用 ,直径大于 0 .2 2 μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用 ,其旁观杀伤效应机理可能是HTB9对HTB9

单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统联合化疗药物治疗前列腺癌

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统联合几种临床常用的化疗药物对激素非依赖性人前列腺癌(HRPC)细胞PC-3m的杀伤效应。方法将HSV-TK基因导入PC-3m细胞,采用活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测单独给予GCV(10μmol/L)和顺铂(CDDP,10μmol/L)、足叶乙甙(VP-16,10μmol/L)、长春新碱(VCR,135 nmol/L)、氨甲喋呤(MTX,5 nmol/L)、5-氟尿嘧啶(5-Fu,1μmol/L)及苏拉明(100μmol/L)等物质,以及GCV联合上述药物对PC-3m细胞的体外杀伤效应,并用流式细胞术(FCM)检测GCV联合5-Fu或苏拉明后细胞坏死和凋亡状况。结果HSV-TK/GCV联合VP-16、VCR、5-Fu和苏拉明后杀伤PC-3m细胞的效应增强,联合CDDP后杀伤效应降低,联合MTX后则杀伤效应无明显改变。FCM检测显示,GCV联合5-Fu和苏拉明后72 h出现较大比例的细胞凋亡和细胞坏死,细胞凋亡比例分别为36.38%和35.51%,细胞坏死比例分别为33.05%和28.87%。结论HSV-TK/GCV系统联合某些化疗药物后可对前列腺癌(PCa)细胞发挥协同的杀伤效应。

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的 :探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV- TK)基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 :应用 PA317细胞包装的逆转录病毒介导的 HSV - TK基因系统 ,在体外以逆转录病毒上清感染法将 TK基因导入 MKN2 8人胃癌细胞 ,并初步观察更昔洛韦 (GCV )对转染 TK基因的 MKN2 8胃癌细胞的杀伤作用。 结果 :TK基因可成功转导入MKN2 8细胞 ,且对细胞的生长状态无明显影响 ,但对 GCV的敏感性却显著增加 ;同时还观察到显著的“旁观者效应”。结论 :逆转录病毒介导的 HSV- TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率 ,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显著的杀伤作用。

hMAM-EP调控HSV-TK腺病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞的靶向杀伤

目的:分别构建人乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)基因增强子和启动子(enhancer and promoter ofhMAM,hMAM-EP)调控的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simple virus thymidine kinase,HSV-TK)自杀基因两种重组腺病毒载体,探讨hMAM-EP调控的HSV-TK在乳腺癌细胞特异性表达及其对乳腺癌的靶向治疗作用。方法:构建hMAM-EP-EGFP和hMAM-EP-TK重组质粒载体,将重组质粒目的基因转移到腺病毒骨架黏粒载体pAxcwit2,并转染HEK 293细胞获得重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK。将Ad-EP-EGFP感染乳腺癌细胞T-47D、ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F,荧光显微镜观察EGFP的表达。将Ad-EP-TK感染T-47D细胞,给予1、10、20、50μg/ml前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV),观察TK基因对乳腺癌细胞的特异杀伤作用。结果:成功构建hMAM-EP调控的重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK。Ad-EP-EGFP感染后,乳腺癌T-47D细胞可见EGFP表达,但ZR-75-30细胞和5-8F细胞无表达。与未感染组或感染Ad-EP-EGFP组相比,Ad-EP-TK重组腺病毒联合GCV(50μg/ml)组T-47D细胞存活率显著降低[(35.69±0.07)%vs(91.74±0.02)%,(87.69±0.11)%;P<0.05],且随GCV质量浓度的增加,T-47D细胞存活率逐渐下降,在MOI=100、GCV质量浓度分别为1、10、20、50μg/ml条件下,细胞存活率分别为(94.34±0.04)%、(86.26±0.02)%、(66.51±0.09)%、(35.69±0.07)%。结论:hMAM-EP调控的HSV-TK自杀基因在乳腺癌T-47D细胞中特异性表达,Ad-EP-TK联合GCV可靶向杀伤乳腺癌T-47D细胞。

非病毒载体介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因治疗卵巢癌的体外研究

目的 探讨靶向非病毒载体GE7在卵巢癌细胞株CAOV3细胞中的转导效率 ,及其介导的Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 (HSV1 tk) /更昔洛韦 (GCV)基因治疗系统在卵巢癌治疗中的应用。方法 构建由表皮生长因子受体 (EGFR)介导的非病毒载体GE7,分别与外源基因 [即报告基因 β 半乳糖苷酶 (β gal)和治疗基因HSV1 tk]构成载体复合物 ,体外转导CAOV3细胞 ,通过 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖苷 (X gal)染色、核酸分子印记杂交分析 ,观察非病毒载体GE7对外源基因 β gal及HSV1 tk基因的转导情况 ;将GCV加入转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞 ,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞仪分析等 ,观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 β gal基因的转导效率可达 80 % ,呈瞬时表达 ;加入 10mg/L的GCV时 ,转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞的生长抑制率可达 95 % ;流式细胞仪分析显示 ,CAOV3细胞S期比例上升 ,最高达 90 % ,凋亡指数高达 30。结论 GE7载体系统能高效地将外源基因导入CAOV3细胞 ,GE7/HSV1 tk /GCV基因治疗系统在卵巢癌治疗中可能具有良好的应用前景。

单纯疱疹病毒胸腺激酶基因系统抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究

目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk)基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖的抑制作用及其作用机制。方法构建含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(tk)SN并转入包装细胞系PT67进行病毒包装,G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清,测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒;聚合酶链反应(PCR)技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTFs细胞,G418筛选并扩大培养,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫印迹法检测tk基因的表达;加不同浓度前药更昔洛韦(GCV)后,以MTT法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用;采用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞;电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL(tk)SN,电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形,直径约100nm;病毒基因组中,PCR扩增出了tk基因;测得病毒滴度为4×107cfu/ml;被转染的HTFs细胞,用RT-PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达;HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性,5×10-3g/L的GCV作用5d可将细胞全部杀死,IC50为6×10-4g/L,HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡,凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论HSV-tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖,作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。(中华眼科杂志,2006,42:212-217)

自杀基因TK腺相关病毒载体的构建及其抑制肿瘤细胞的功能研究

目的探讨腺相关病毒（rAAV）-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidinekinase,HSV-TK）（简称rAAV-TK）载体的构建及其生物学效应的初步鉴定。方法用PCR扩增TK序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-TK;采用AAV-Helper Free System包装系统、＂氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提＂及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩,对病毒颗粒进行鉴定;用MB49-PSA细胞对rAAV-TK生物学效应进行初步鉴定。结果成功构建pAAV-TK载体,并经酶切、PCR及测序验证其准确性;rAAV病毒颗粒滴度达2×1010 v.p/mL,浓缩后可达到2×1011~2×1012 v.p/mL;rAAV-TK可以分泌TK基因,加入药物更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）和吉地他滨（Gemcitabine,GVC）,该基因能有效诱导膀胱肿瘤细胞MB49-PSA凋亡。结论成功构建rAAV-TK腺相关病毒,体外实验表明rAAV-TK/GVC/GCV系统能高效诱导膀胱肿瘤细胞的凋亡。

聚焦超声介导阳离子脂质体携带HSV-TK增强基因转染及联合更昔洛韦对大鼠胶质瘤C6细胞的影响

目的探讨聚焦超声对载单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因阳离子脂质体体外基因转染的影响,及其联合更昔洛韦(ganciclovir,GCV)对大鼠脑胶质瘤C6细胞的影响。方法制备含HSV-TK基因质粒,利用阳离子脂质体转染至对数期大鼠胶质瘤C6细胞,并随机分为脂质体组和超声1、2、3、4min组,脂质体组加入含9μg阳离子脂质体-HSV-TK基因质粒的100μL培养液;超声1、2、3、4min组在脂质体组基础上分别给予体外超声(1 MHz,功率3W/cm2,电压150mvPP)辐照1、2、3、4min。5组C6细胞均于37℃、体积分数5%CO2培养箱,含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液,继续培养48h。转染48h后,荧光显微镜下观察载HSV-TK基因阳离子脂质体转染效率。将对数生长期C6细胞接种于96孔板,依据转染效率实验结果分为GCV组、超声3min+GCV组,超声3 min+GCV组加入9μg阳离子脂质体-HSV-TK基因质粒的100μL培养液,并超声辐照3min,GCV组转染空白阳离子脂质体;转染24h后,2组均分别加入0.1、1、10、50、100、1 000mg/L GCV作用48h,采用分光光度法检测C6细胞存活率。结果转染48h后,超声1、2、3、4min组C6细胞HSV-TK基因转染效率[(0.14±0.07)%、(1.39±0.11)%、(19.61±4.80)%、(18.81±7.92)%]均高于脂质体组[(0.05±0.01)%](P<0.05),且超声3、4min组转染效率高于超声1、2min组,超声2 min组转染效率高于超声1 min组(P<0.05),超声3 min组与超声4min组转染效率比较差异无统计学意义(P>0.05);随GCV浓度增加,GCV组和超声3min+GCV组C6细胞存活率均逐渐降低;GCV为50、100、1 000mg/L时,超声3min+GCV组C6细胞存活率[(85.88±1.80)%、(75.51±1.43)%、(68.17±5.26)%]均低于GCV组[(95.40±0.85)%、(92.62±4.50)%、(83.66±0.98)%](P<0.05);GCV为0.1、1、10mg/L时,超声3min+GCV组C6细胞存活率[(99.32±3.01)%、(97.01±1.53)%、(94.50±1.15)%]与GCV组[(99.56±5.14)%、(98.60±5.18)%、(97.39±8.06)%]比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论聚焦超声体外辐照可明显提高载HSV-TK基因阳离子脂质体转染效率,增强GCV的抗胶质瘤作用。

胸苷激酶基因系统杀伤前列腺癌细胞的流式细胞术分析

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)自杀基因系统诱导人-前列腺癌细胞死亡的机制。方法利用脂质体介导的基因转染技术将携带HSV-TK基因的EB病毒表达载体导入激素非依赖性人前列腺癌(HRPC)细胞系PC-3m并给予GCV,采用流式细胞术(FCM)观察PC-3m细胞周期变化以及细胞坏死和凋亡情况。结果HSV-TK/GCV系统可使PC-3m细胞周期S期比例升高,高浓度GCV组尤其明显,S期细胞比例由16.73％升至33.60％;10和100μmol/L GCV作用72 h后,PC-3m细胞可出现较为明显的细胞坏死和凋亡,比例分别为13.54％、12.45％、34.70％和10.11％。结论细胞坏死和凋亡均参与了HSV-TK/GCV系统诱导的PCa细胞死亡,以细胞坏死比例稍高;TK自杀基因系统杀伤前列腺癌细胞时可能不依赖于其p53表达背景,因而具有更广阔的应用前景。

乏氧条件启动HRE调控HSV-TK／GCV效应链对人肺腺癌A549细胞杀伤作用的观察

目的:观察由缺氧反应元件(HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统对乏氧环境中的人肺腺癌细胞系A549细胞的杀伤作用。方法:将HRE调控HSV-TK和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达的真核载体pHRE-TK通过脂质体导入A549细胞,分别在乏氧(O2浓度为3%)和常氧(O2浓度为21%)环境中培养,荧光显微镜观察重组载体转染A549细胞后报告基因EGFP表达变化,并进行荧光光密度(FOD)分析;再予以GCV处理5d后,用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果。设立分别仅含有HRE、HSV-TK以及两者均无的3个荧光表达载体(pHRE、pTK、pEGFP)为对照组。结果:在乏氧环境中,由HRE调控的重组载体pHRE-TK和pHRE转染A549细胞后,其FOD值高于无HRE调控的载体pTK和pEGFP转染组P<0.01;而在常氧环境中各组细胞之间FOD值差异无统计学意义,P>0.05。携带HSV-TK基因的重组载体pHRE-TK和pTK转染A549细胞后,细胞对GCV的敏感性均高于无HSV-TK基因的pHRE组细胞,P<0.01;敏感性随GCV浓度增加而增大。在乏氧环境中培养的pHRE-TK组细胞对GCV的敏感性高于pTK组(P<0.01),亦高于在常氧环境中培养的pHRE-TK组细胞,P<0.01;而在常氧环境中,pHRE-TK组与pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义,P>0.05。结论:在乏氧的A549细胞内,HRE使报告基因EG-FP表达增强;HRE能增强HSV-TK/GCV系统对乏氧环境中的A549细胞的杀伤效率。

9L-rIL12-TK大鼠胶质瘤基因免疫疫苗的安全可控性体内实验研究

目的评估9L-rIL12-TK脑胶质瘤基因免疫活细胞疫苗在体内的安全可控性。方法将40只裸鼠随机分成3组,分别于右侧腋部皮下接种9L-rIL12-TK细胞(n=14)、9L-TK细胞(n=14)和9L细胞(n=12),7d后将各组裸鼠分成两亚组,实验组(n=8,8,6)给予更昔洛韦(GCV)干预实验,对照组(均n=6)给予生理盐水注射,连续7d;观察裸鼠瘤体生长情况和生存时间,60d后取瘤结节及全身脏器行组织学检查(苏木精-伊红染色)。结果①给予GCV干预后7d,9L-rIL12-TK实验组及9L-TK实验组裸鼠瘤体平均体积较相应对照组及9L组显著性缩小(均P<0.05)。60d时,8只9L-rIL12-TK实验组裸鼠瘤体均完全消退,且均无复发;8只9L-TK实验组裸鼠中,瘤体完全消退3只,瘤体缩小后再次增大5只;余亚组瘤体均呈增大趋势。②GCV干预后,9L-rIL12-TK实验组和9L-TK实验组与相应对照组比较,生存时间明显延长(P<0.05)。③9L-rIL12-TK实验组和9L-TK实验组无瘤裸鼠接种部位无异型性肿瘤细胞,余裸鼠瘤体内均见异型性肿瘤细胞;所有裸鼠相关脏器病理学检查均未见肿瘤远处转移征象。结论9L-rIL12-TK大鼠胶质瘤细胞基因免疫疫苗在裸鼠体内可得到安全有效的控制,使制备免疫原性强且安全有效的胶质瘤基因免疫活细胞疫苗策略成为可能;其基因免疫治疗效应有待进一步研究。