腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归

目的 :用转基因技术标记组织工程种子细胞 ,探索一种追踪种子细胞转归的方法。 方法 :用腺病毒荧光表达载体转染人皮肤成纤维细胞 ,观察转染率及其荧光表达。再将细胞种植在真皮支架上 ,活体观察荧光标记的效果和持续时间。结果 :所制备的腺病毒荧光表达载体能转染靶细胞 ,转染率 >95 %。转染的细胞经一次传代后 ,尽管荧光强度降低 ,细胞轮廓仍清晰可见。细胞种植至真皮支架上 ,观察 2周 ,可以在荧光显微镜下较清晰地观察到培养物活体上细胞的形态。结论 :应用腺病毒荧光表达载体标记皮肤组织工程种子细胞以追踪细胞的转归是方便。

增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体构建及其在移植干细胞示踪和定量中的初步应用

目的:构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体,并观察其在移植真皮多能干细胞示踪和定量中的应用。方法:实验于2004-08/2005-10在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成。①细菌内同源重组构建含增强型绿色荧光蛋白基因的骨架质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,包装出增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体。增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体鉴定正确后,收集293细胞反复冻融离心收集上清,粗制病毒液感染293细胞,扩增重组病毒载体。②选取新生1d雄性大鼠1只作为供体,剪取皮肤进行真皮多能干细胞的分离培养鉴定。将第7代粗制病毒液加入生长状态良好的真皮多能干细胞,转染后5d观察绿色荧光蛋白阳性细胞数量,计数绿色荧光蛋白阳性细胞百分比。③选取60只成年Wistar大鼠作为受体,随机分为全身照射组和正常对照组,各30只。全身照射组大鼠接受总剂量为5Gy的γ射线照射,正常对照组不接受放射。两组大鼠均接受尾静脉移植的1mL增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体转染的真皮多能干细胞悬液。两组分别于照射后5d,1,2,3,4周荧光显微镜下观察真皮多能干细胞在骨髓组织中的分布情况,每个时相点6只大鼠;同时定量分析骨髓中真皮多能干细胞的含量。结果:作为受体的60只大鼠全部进入结果分析。成功地构建了增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体,并发现其可转染和标记真皮多能干细胞。增强型绿色荧光蛋白标记的真皮多能干细胞在移植后4周内在大鼠体内的分布可被有效地检测,荧光激活细胞分类结果显示全身照射组大鼠骨髓中真皮多能干细胞的含量从移植后5d～4周均明显高于正常对照组大鼠(P<0.01)。结论:增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体可有效地标记真皮多能干细胞,并能很好地示踪和定量分析移植到大鼠体内真皮多能干细胞的分布情况。

带绿色荧光蛋白的米非司酮诱导表达腺病毒载体的构建及表达

目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6.6×1010pfu/ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad-RUEGFP能调控外源基因的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。

常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白报告分子腺病毒真核表达载体的构建(英文)

背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导生理功能完整的新血管生成。目的:构建能够同时表达突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)报告分子的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法:对目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人低氧诱导因子1α基因进行测序和对其序列内部限制性内酶识别位点进行分析,利用PCR(poly-merase chain reaction,PCR)技术定点突变低氧诱导因子1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸,酶切、测序检测突变情况,将正确突变后的低氧诱导因子1α基因(突变mutagenesis,突变后的HIF-1α基因写作HIF-1αmu)定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。携带HIF-1αmu基因的重组腺病毒穿梭载体经测序鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,利用细菌内同源重组机制将HIF-1αmu和人源化绿色荧光蛋白基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒,通过PacⅠ酶切及测序鉴定获得重组体。结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。结果表明,成功构建了新型重组腺病毒突变型真核细胞表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1。

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBankSpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列(含启动子)和3′端侧翼序列(含终止子),将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt_gfp。将pSplt_gfp与野生型SpltMNPV基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV_gfp。SpltMNPV_gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。

绿色荧光蛋白cDNA在腺病毒重组载体转染中的应用

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因是目前发现的唯一能在细胞内表达，且不需要其他外源底物参与的全新报告基因．将ＧＦＰｃＤＮＡ与腺病毒载体ｐＡｄＥ１ＣＭＶ重组，以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染２９３细胞（一种人胚肾细胞），观察其在真核细胞内的表达情况，为转基因技术提供了新的监测方法．

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。

腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠成体肝干细胞中的表达

目的:研究腺病毒感染成体肝干细胞介导外源基因表达的可行性及建立稳定表达EGFP的成体肝干细胞.方法:采用细菌同源重组法构建CMV驱动的EGFP报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP,在293细胞中包装制备腺病毒,并用重组腺病毒感染体外培养的成体肝干细胞WB-F344,观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达,及分析病毒对肝干细胞的感染效率.进一步单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WB-EGFP),并采用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性.结果:成功构建腺病毒载体,并包装制备高滴度的重组腺病毒Ad-EGFP.重组腺病毒有效的感染WB-F344细胞,感染率约40-70%.建立WB-EGFP细胞株,持续传代8-9代均较稳定表达EGFP及肝干细胞表面标记,仍保持干细胞样的增生、分化等基本生物学特性.结论:腺病毒可高水平的介导外源基因表达于成体肝干细胞,是有效的基因转移系统.稳定表达EGFP的肝干细胞株观察直观、可连续传代,并保持干细胞的生物学特性,可用于体内外肝细胞研究中的追踪、鉴定.

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验

背景:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势。目的:观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓间充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性。设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成。材料:新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0～3.0kg。方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103～1×1010PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率。主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFPBMSCs向神经样细胞的定向分化。结果:3～6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性。当病毒滴度为1×107PFU/mL时感染率为55%,1×109,1×1010PFU/mL感染率均为85%,但1×1010PFU/mL时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d仍可见荧光表达。感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性。结论:合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。

含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达

目的 构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法 载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果 成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论 成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 。

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶 (mDHFR)和绿色荧光蛋白 (GFP)融合基因的重组腺相关病毒 (AAV)载体 ,并使其在NIH3T3细胞中表达 ,观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段 ,并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起 ,插入T载体 ,酶切后插入AAV载体 ,包装成病毒后感染NIH3T3细胞 ,通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察。结果 :PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA ,荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为 2 5 % ,MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强。结论 :AAV载体可以将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达 ,使其对MTX的耐药性增强 。

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)基因导入慢病毒载体质粒pLenti6/V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒、包膜蛋白质粒等)共转染入293细胞进行包装,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72 h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为107U/mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。

绿色荧光蛋白基因TuMv病毒表达载体的构建

本研究通过设计引物进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因,将PCR产物酶切以后与芜菁花叶病毒表达载体相连,得到的阳性克隆通过多对引物组合进行PCR验证及序列测定,说明GFP基因已经连接到该病毒表达载体中,而且没有发生碱基误配及错配。该GFP表达载体的构建为进一步利用TuMv的全长cDNA侵染性克隆进行外源基因的转化奠定了基础。

以黄瓜花叶病毒为载体表达绿色荧光蛋白

为了构建基于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外源蛋白表达载体,实验在获得CMV的LS株系(CMV-LS)农杆菌侵染性克隆(pCB301-R1,R2和R3)的基础上,将CMV-LS基因组RNA3的外壳蛋白(coat protein,CP)基因置换成绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因,研究以CMV-LS为载体在本氏烟中表达GFP基因的情形。农杆菌浸润接种结果表明,以R1R2R3-gfp为载体在寄主中的GFP表达量远高于植物瞬时表达载体pCB301产生的GFP,番茄丛矮病毒基因沉默抑制子p19加入有助于CMV表达GFP,将移动蛋白(movement protein,MP)缺失C端的33个氨基酸残基而构建表达载体R1R2R3mpΔ33-gfp在寄主中的GFP含量大大增加。农杆菌菌液稀释接种的结果表明R1R2R3mpΔ33-gfp接种OD600值为0.01均能有效在本氏烟中表达产生GFP。

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接、转化、提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性。结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性。结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础。

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的 :构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。 方法 :应用RT PCR方法扩增人转化生长因子基因 ,与GFP真核表达载体连接 ,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体 ,并用限制性内切酶酶切鉴定。 结果 :构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序 ,证实新质粒的构建成功。 结论 :应用RT PCR方法扩增目的DNA片段 ,简单快捷 ;双酶切定向克隆可以保证构建一步到位 ,免去正反向重组体筛选的问题。

绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEG-FP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用NheⅠ和AgeⅠ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr+LB平板上筛选阳性克隆。重组子经NheⅠ和AgeⅠ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选。结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础。