CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)后的表达情况。方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,再与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4)。将验证正确的pAdEasy/CXCR4用PacⅠ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(AdvCXCR4)。用AdvCXCR4转染dMSCs,并采用RTPCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况。结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体。同时,AdvCXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达。结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础。

人Smad7腺病毒表达载体的构建及体外表达

用DNA直接克隆连接的方法,构建人Smad7腺病毒重组质粒,再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,用RT-PCR方法检测细胞中人Smad7mRNA的转录。经酶切和PCR鉴定证实了人Smad7重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的Smad7mRNA的过度表达。结果证实构建的人Smad7腺病毒表达载体可在体外细胞中表达,并可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗方面的研究。

人HIF-1α的腺病毒表达载体的构建与分析(英文)

低氧诱导因子 1(hypoxiainduciblefactor 1,HIF 1)是由HIF 1α和HIF 1β组成的异源二聚体转录因子 ,在细胞的氧平衡过程中起重要作用。在应答低氧信号时 ,HIF 1α亚基表达水平上调 ,并通过激活参与细胞能量代谢、红血细胞生成以及血管生成的靶基因表达 ,达到保护局部缺 贫血细胞免于凋亡或死亡 ,而后者则是临床上影响大脑和脊椎神经损伤恢复的主要原因。为了达到基因治疗急性神经损伤的目的 ,我们构建了表达HIF 1α的重组腺病毒载体。实验表明 ,重组腺病毒可以在大肠杆菌中组装 ,并在HEK2 93T细胞中包装。包装后的HIF 1α重组腺病毒载体的病毒感染效率为 2× 10 1 3CFU ,外源基因HIF 1α在He1a细胞中的表达 6h后达到峰值。目前正在开展建立在此基础上的急性神经损伤动物模型试验。

β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达

目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD 2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD 2转化E.coli B J5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pA dE asy-1发生同源重组,重组质粒pA dE asy-rBD 2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用W estern b lot与免疫组化方法检测其表达。结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/m l,W estern b lot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。

人IL-21cDNA的克隆及重组腺病毒表达载体的构建

目的:构建含人IL-21基因的重组腺病毒表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤研究奠定基础。方法:从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,将其连接到进入载体pENTR1A,然后经LR重组转入到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中,构建含IL-21基因的腺病毒载体(Ad-IL-21),并进行测序鉴定和PCR鉴定。结果:Ad-IL-21表达载体测序结果与GenBank中IL-21基因序列一致,Ad-IL-21经PCR扩增出IL-21基因片段。结论:成功构建携带人IL-21基因的重组腺病毒表达载体。

人肝素酶基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建人肝素酶正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoRI从pcDNA3-hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRI酶切位点上,经BamHI酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正义重组质粒进一步采用测序鉴定其方向性.结果:经BamHI酶切后,正义质粒形成4.3+1.4kb两条带,而反义重组质粒为5.1+0.4kb两条带,与理论计算值完全一致;测序结果与GeneBank报告的肝素酶序列完全一致.结论:成功构建了人肝素酶的正、反义腺病毒表达载体,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.

腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N的构建及表达

目的构建携带Son ic hedgehog氨基端(Shh-N)基因的腺病毒表达系统并在包装细胞中制备相关病毒颗粒,以用于中枢神经系统疾病的基因治疗。方法应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增Shh-N,然后克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pAdTrack-CMV,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdEasy-1进行重组,构建pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,然后转染包装细胞293细胞系。结果成功获得Shh-N片段并构建了缺陷型腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,经限制性酶切后证实该表达载体含Shh-N基因,在293细胞中小规模扩增病毒后,经PCR检测证实病毒颗粒中存在Shh-N基因。结论获得了携带Shh-N的腺病毒颗粒,可将之用于基因修饰神经细胞,进行促细胞存活和定向分化诱导研究,为自身干细胞和外源性细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床应用提供理论和实验基础。

Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体的构建与表达

背景:单核细胞趋化因子(monocyte chemotacti cprotein,MCP)可促进新生血管的动脉化,形成功能性微动脉,进而实现血管新生。目的:构建Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体,包装、纯化并检测病毒滴度,观察其在体表达。方法:PCR法钓取目的基因MCP-1,将其亚克隆入pDC315-EGFP载体,利用辅助包装质粒pBHGloxΔE1,3Cre进行病毒包装得到Ad-EGFP-MCP-1,经呼吸道途径转染至肺动脉高压大鼠。结果与结论:通过PCR获得MCP-1全长cDNA,与GenBank比对,序列完全一致。荧光显微镜下可见所包装的Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体可在大鼠肺组织中稳定表达,1周时达高峰,持续约4周。证实实验成功构建并包装了Ad-EGFP-MCP-1,其在肺组织中可有效表达。

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接、转化、提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性。结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性。结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础。

小鼠角质化细胞生长因子及其受体的重组腺病毒表达载体的构建

【论文特点介绍】既往研究表明角质化细胞生长因子（KGD对急性起病的ALI／ARDS，以及慢性进展的PF均有预防作用。因此，构建KGF、KGFR的重组腺病毒载体对于探索肺部疾病的治疗，探讨KGF，乃至其他生长因子在肺损伤免疫进程中的作用都是一个有力的工具。

重组腺病毒CXCL12基因表达载体的构建及其转染间充质干细胞后对其Runx2基因表达的影响

目的:构建趋化因子CXCL12的重组腺病毒表达载体,观察其对间充质干细胞(MSC)中成骨特异性转录因子Runx2表达的影响。方法:将目的基因CXCL12全长c DNA模板进行PCR扩增、酶切后与p HBAd-MCMV-GFP载体结合,获得p HBAd-MCMV-CXCL12-GFP重组载体;将重组载体和包装质粒共转染HEK293细胞进行包装、扩增;利用所携带的绿色荧光蛋白基因测定病毒滴度,观察基因转染效率,QPCR和Western印迹检测CXCL12重组腺病毒转染后MSC中CXCL12和Runx2的表达。结果:酶切、PCR及测序结果证实CXCL12重组腺病毒载体构建成功,转染MSC后CXCL12和Runx2的表达明显升高,AMD3100可以降低CXCL12基因转染后MSC中Runx2的表达。结论:趋化因子CXCL12和MSC表面的CXCR4结合对MSC中成骨特异性转录因子Runx2的表达具有促进作用。

人BMP-4腺病毒表达载体对人退变腰椎间盘细胞的影响

目的研究人BMP-4腺病毒表达载体(adenovirus human BMP-4,Ad-hBMP-4)转染体外培养人退变腰椎间盘细胞后,对细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9表达的影响。方法取Ad-hBMP-4重组腺病毒进行扩增,并检测病毒滴度。取ModicⅢ级、27～50岁腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的退变椎间盘体外分离、培养椎间盘细胞,激光共聚焦显微镜观察Ⅱ型胶原在细胞中的表达。取第1代椎间盘细胞转染Ad-hBMP-4重组腺病毒(实验组),应用RT-PCR和Western blot法分别检测病毒转染后3、6 d细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Sox9基因及蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白的表达,与未转染细胞(对照组)进行比较。结果 Ad-hBMP-4重组腺病毒滴度为5×106PFU/mL。激光共聚焦显微镜观察示Ⅱ型胶原主要表达于椎间盘细胞质。Ad-hBMP-4重组腺病毒转染后细胞形态无明显变化。转染3、6 d后实验组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Sox9 mRNA表达以及蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白表达均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组各指标3、6 d间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad-hBMP-4可有效转染体外培养人退变椎间盘细胞,促进细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9表达,提示hBMP-4可能对早期退变的椎间盘具有修复功能。

AKT3基因重组腺病毒表达载体的构建及其对BT474乳腺导管癌细胞增殖的影响

目的构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体，探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响。方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3eDNA，以XhoI及最g21I酶切位点克隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体，测序鉴定后与骨架载体PAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，获得重组腺病毒表达载体pAd．AKT3后，转染293A细胞，进行病毒的包装。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光，测定病毒效价，Western印迹方法分析细胞内AKT3蛋白质的表达。通过MTr实验，研究AKT3过表达前后BT474乳腺导管癌细胞增殖的变化。结果重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误。重组腺病毒效价为2．6×10^8pfu／ml，重组腺病毒转导后，BT474乳腺导管癌细胞中可检测到AKT3的过表达：Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在BT474细胞中表达良好。而转导空载体腺病毒及未转导细胞对照中未见有此融合蛋白质条带；MTr结果显示AKT3表达上调的重组腺病毒组，其增殖活性显著高于转导空载体腺病毒组及未转导细胞组，差异具有统计学意义（P〈0．01），而后两者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功地构建了AKT3重组腺病毒表达载体，AKT3过表达可增强BT474乳腺导管癌的增殖，为进一步研究AKT3的功能奠定了基础。

腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归

目的 :用转基因技术标记组织工程种子细胞 ,探索一种追踪种子细胞转归的方法。 方法 :用腺病毒荧光表达载体转染人皮肤成纤维细胞 ,观察转染率及其荧光表达。再将细胞种植在真皮支架上 ,活体观察荧光标记的效果和持续时间。结果 :所制备的腺病毒荧光表达载体能转染靶细胞 ,转染率 >95 %。转染的细胞经一次传代后 ,尽管荧光强度降低 ,细胞轮廓仍清晰可见。细胞种植至真皮支架上 ,观察 2周 ,可以在荧光显微镜下较清晰地观察到培养物活体上细胞的形态。结论 :应用腺病毒荧光表达载体标记皮肤组织工程种子细胞以追踪细胞的转归是方便。

人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

为构建人血管内皮细胞生长因子（VEGF）165腺病毒表达载体，体外转染大鼠骨髓问充质干细胞，并研究其相关特性，采用细菌内同源重组技术快速构建Ad—VEGF165腺病毒重组质粒，经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad—VEGF165腺病毒，并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。研究发现，酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165 cDNA，电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在，测定包装的病毒滴度为6．3×10^10 TCID 50／ml。逆转录一聚合酶链反应（RT～PCR）、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF。的转录和表达。提示：构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞，并在体外高效表达。

HVEM重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的HVEM突变体和EGFP共表达复制缺陷型腺病毒载体的构建与鉴定。方法RT-PCR获得人HVEM的cDNA,使其与LIGHT分子结合的表位点突变,保留与BTLA结合的关键位点。构建经修饰的HVEM基因的复制缺陷型腺病毒载体Adv-mHVEM-IRES2-EGFP并对其进行鉴定和转染效率测定。结果成功构建HVEM突变体和EGFP复制缺陷型腺病毒载体,经过测序与预期一致。该载体能够表达突变的HVEM和EGFP蛋白,体外培养细胞转染效率达到95%以上。结论构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HVEM突变体和EGFP蛋白,对体外细胞具有高效转染能力。

重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1(RAMP1)基因的腺病毒表达载体,为进一步深入研究RAMP1的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中;I-Ceu I+I-Sce I双酶切穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1,将回收的GFP-CMV-RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定。结果构建的重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1双酶切后,得到0.8kb(RAMP1)和5.1kb(pShuttle-GFP-CMV)两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-CMV-RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad-RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4.5×1011PFU/ml。结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMP1的功能研究奠定了基础。

SOX9腺病毒过表达载体的构建及其对犬ADSCs向胰岛样细胞分化的影响

脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞。SOX9是胰腺发育调控网络中的多潜能因子,其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭。但到目前为止,SOX9在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中是否具有重要作用尚不完全清楚。本试验构建了腺病毒过表达重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy,并获得了具有感染性的腺病毒毒液,将其感染犬ADSCs,感染后4、7、10、13 d和16 d观察绿色荧光蛋白表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,过表达SOX 9基因的腺病毒毒液感染犬ADSCs后,出现绿色荧光蛋白表达;并在第13天细胞开始出现聚集生长现象,在第16天出现多个似胰岛样细胞团;同时检测到SOX9可外源性刺激Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK 1和PCSK 2等基因的内源性表达。表明SOX 9基因过表达腺病毒毒液可成功感染犬ADSCs,促进其向胰岛样细胞分化。

腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用

目的探讨腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用。方法采用直接感染法、台盼蓝活细胞计数、MTT、Hoechst染色法及流失细胞仪检测等方法,绘制SKOV3细胞生长曲线及倍增时间,检测SKOV3细胞感染重组病毒前后其顺铂的IC50值、细胞凋亡形态及细胞各周期的分布。结果 (1)顺铂浓度与SKOV3细胞抑制率呈线性正相关,相关系数r=0.9905(P<0.05),顺铂IC50值为(7.76±0.37)μg/ml;腺病毒载体介导的RNA干扰ERCC1基因表达后,SKOV3细胞的生长受到一定程度的抑制;(2)与对照组相比,梯度浓度的重组腺病毒感染后,SKOV3细胞对顺铂的敏感性分别增加了9.4%、16.4%、23.2%、33.5%,呈剂量依懒性;(3)梯度滴度重组腺病毒表达载体联合顺铂作用于SKOV3细胞株,细胞凋亡显著增高;(4)重组腺病毒表达载体感染并联合顺铂用药,G1期细胞比例减小,S期细胞比例增大,细胞凋亡率进一步增高。结论重组腺病毒表达载体可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤细胞周期分布等途径增加SKOV3细胞对顺铂的敏感性。

钙网蛋白融合HBsAg基因重组腺病毒新型载体疫苗的构建与鉴定

目的:构建表达钙网蛋白(calreticulin,CRT)与乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)融合基因重组腺病毒载体(Ad-CRT/HBsAg),为研发新型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗性疫苗奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPowerTM Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HBsAg基因融合重组的pJW4303表达载体,在构建过程中给融合基因加上特定的CACC接头,再克隆入载体pEN-TR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆Ad-CRT/HBsAg。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测Ad-CRT/HBsAg载体是否能正确表达目的蛋白。结果:构建的含有CRT/HBsAg融合基因的腺病毒表达克隆,经PCR和测序鉴定构建正确。重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增,获得的病毒滴度为2.68×1011 pfu/ml,且这个重组病毒载体能正确表达CRT/HBsAg融合蛋白。结论:成功构建了CRT/HBsAg融合基因重组腺病毒载体(rAd-CRT/HBsAg),为此重组载体用于治疗HBV慢性感染以及HBsAg阳性肝癌奠定基础。