基因治疗脊髓损伤中Ad(腺病毒)-NGF(神经生长因子)的应用研究

目的:应用Ad-NGF转染成纤维细胞治疗脊髓半切模型大鼠探讨在基因治疗脊髓损伤中腺病毒作为载体介导的NGF对脊髓损伤的治疗价值。方法:主要材料为Ad-NGF,293细胞,成纤维细胞,大鼠等。成纤维细胞与Ad-NGF悬液混合培养,将细胞注射至脊髓半横切损伤模型大鼠局部。结果:NGF因子在体外实验组可检测到。Ad-NGF转染组单位面积上神经轴突数量比对照组多。结论:NGF因子在体外实验组得到表达,体内修饰组有NGF表达。证实Ad-NGF转染成纤维细胞通过促进脊髓损伤大鼠神经轴突的生长促进损伤神经功能的恢复。

神经生长因子对骨骼形成及骨疾病的影响

背景:神经生长因子在骨骼的生理和病理进程中发挥了重要作用,系统性分析神经生长因子对骨组织的影响在组织工程及临床治疗两方面都具有重要意义。目的:探究神经生长因子通过骨组织细胞和骨神经-血管耦合等途径调控骨形成的过程,同时研究神经生长因子在骨相关疾病病理进程中的作用。方法:在中国知网、万方、PubMed数据库以“神经生长因子,TrkA,骨,软骨”为中文检索词,以“Nerve growth factor,TrkA,NGF,bone,cartilage”为英文检索词进行文献检索,共检索到2 925篇文献。经过筛选后纳入116篇文献进行归纳总结,撰写综述。结果与结论:神经生长因子既可在骨、软骨、神经、血管等组织细胞中表达,又可作用于这些细胞发挥调控作用。通过多种分泌调控方式,神经生长因子在骨组织内部和骨、神经、血管组织间发挥信号传导作用。通过促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化,神经生长因子可促进骨形成及骨修复。神经生长因子介导的破骨细胞生成说明其对骨组织具有多向调控作用。同时,神经生长因子与多种骨科疾病的发生发展高度相关,可能提供新的临床治疗思路。对神经生长因子的研究是了解骨骼生理及病理变化的重要方向之一。

小鼠神经生长因子前导肽和人内吗啡肽-2融合基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:制备并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人内吗啡肽-2(EM-2)融合基因的重组非增殖型腺病毒。方法:PN-EM-2目的基因经酶切插入pAxCAwt载体,构建PN-EM-2-pAxCAwt重组黏粒,脂质体转染293细胞获取重组腺病毒。PCR鉴定后扩增不含野生型病毒的阳性克隆并纯化,采用TCID50法测定病毒滴度;体外感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,酶联免疫反应(EIA)法测定表达产物浓度。结果:融合基因序列正确,PCR可检测到401bp的融合基因条带并排除野生病毒株,腺病毒Ad-PN-EM-2滴度为2.03×1010pfu/ml。NIH3T3细胞转染病毒后,细胞培养液内可检测到EM-2的表达,明显高于空转染及未转染细胞(P<0.05),且随时间的延长,表达水平逐渐上升。结论:成功构建能够在非神经内分泌细胞内转基因表达成熟人EM-2的非增殖型腺病毒,为进一步将其应用于慢性疼痛的基因治疗奠定了基础。

人类神经生长因子β基因重组腺病毒载体的构建

目的:为研究人神经生长因子β(hNGFβ)基因对慢性神经病理性痛的治疗作用,构建人类神经生长因子β基因重组腺病毒载体。方法:将hNGFβ外源性核酸片段插入到pBluescriptⅡSK(+)的XmaⅠ与XbaⅠ位点,构建成pBluescriptⅡSK(+)hNGFβ,再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV经KpnⅠ和NotⅠ双酶切后,构建成转移质粒pShuttleCMVhNGFβ,将该转移质粒经PmeⅠ酶切后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的感受态菌BJ5183,重组为pAdEasy1hNGFβ,经PCR鉴定后,LipoVec介导pAdEasy1hNGFβ转染AD293细胞,将透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定。并进行自动测序鉴定。结果:线性化的pShuttleCMVhNGFβ转化含pAdEasy1的感受态菌BJ5183,24h后获得了30%阳性重组质粒,经酶切得到一个大于20kb的大片段和一个4.5kb的特征性条带,PCR扩增出731bp片段。pAdeasy1hNGFβ经PacI酶切线性化后,转染Ad293细胞包装成表达hNGFβ的重组腺病毒。260nm处吸光值测病毒滴度为2.24×1012OPU·L-1。重组AdhNGFβ腺病毒质粒经上海基康生物技术有限公司自动测序鉴定为目的基因。结论:应用细菌内同源重组能快速构建AdhNGFβ,为hNGFβ基因在神经病理性痛中的应用奠定了基础。

腺病毒介导的神经生长因子基因治疗大鼠坐骨神经损伤的疗效研究

目的观察腺病毒介导神经生长因子(Ad-NGF)基因治疗对大鼠坐骨神经损伤修复的疗效。方法取SD大鼠16只,切断右侧坐骨神经并缝合,随机分为Ad-NGF治疗组、神经生长因子(NGF)局部注射组、空腺病毒载体组和生理盐水(NS)局部注射组。术后第31天行坐骨神经功能指数及神经电生理测定,Western blot检测神经生长因子蛋白质表达水平。结果腺病毒介导神经生长因子较其余3组可显著增加局部NGF蛋白质表达水平,改善坐骨神经功能指数和神经传导速度。结论腺病毒介导神经生长因子基因治疗可有效促进大鼠坐骨神经损伤后修复。

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

【目的】构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF_(165))基因的重组腺病毒载体并观察其在 C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础。【方法】将 VEGF_(165)基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,获得重组质粒 pAdTrack VEGF_(165)。经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 共同转染大肠杆菌 BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒 pAdCMV VEGF_(165),转化体外培养的 C17.2神经干细胞。通过 RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot 法检测其在 C17.2神经干细胞中的表达。【结果】重组腺病毒 AdCMV VEGF_(165)在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×10^(11)efu/mL。病毒上清液经 ELISA 检测VEGF_(165)表达的量为(1135±138)ng/L。重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达。【结论】成功构建 pAd VEGF_(165)重组腺病毒,获得了稳定表达 VEGF_(165)的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础。

清肺口服液对3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纤维细胞转化生长因子-β1和血小板衍生生长因子-BB蛋白表达的影响

目的探讨清肺口服液含药血清对腺病毒3Ⅰ、7b感染的人胚肺成纤维细胞之转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)蛋白表达的影响。方法细胞分为正常细胞组、病毒对照组、空白血清组、利巴韦林组和含药血清组,除正常细胞组外,其余4组均以3Ⅰ、7b型腺病毒分别攻击之,并分别加入相应药物至各组细胞中;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组细胞上清液中TGFβ1、PDGFBB的含量。结果病毒对照组较正常细胞组细胞中TGFβ1、PDGFBB含量均明显增多(P<0.01),含药血清组比病毒对照组的细胞TGFβ1、PDGFBB含量显著降低(P<0.01)。结论(1)腺病毒感染可使人胚肺成纤维细胞TGFβ1、PDGFBB蛋白表达增高;(2)清肺口服液可降低TGFβ1、PDGFBB细胞因子的蛋白表达,这可能是其抗病毒作用的机制之一。

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的 构建含有大鼠 β NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达 ,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础。方法 设计一对含有HindⅢ及SalⅠ酶切位点的 β NGF基因上下游引物 ,PCR法扩增含有大鼠 β NGFcDNA的质粒pUC19 β NGF ,产物经HindⅢ及SalⅠ双酶切 ,插入腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV ,获得重组质粒pAdTrack β NGF ,经PmeⅠ酶线性化后 ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1共同转入BJ5 183中进行同源重组 ,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析 ,阳性克隆经 2 93细胞包装 ,扩增 ,空斑法测定病毒滴度 ,转化体外培养的星形胶质细胞。通过RT PCR、ELISA、Westernblot法检测其在星形胶质细胞中的表达。结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体 pAd β NGF ,重组腺病毒在 2 93细胞中包装成功 ,病毒滴度达 2× 10 11PFU/ml。病毒上清液经ELISA检测 ,β NGF表达的量为 (94 5 0± 4 5 8)ng/L。 结论 该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础。

人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体构建及其在C17.2神经干细胞的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达。方法:实验于2004-03/11在中山大学附属第二医院林百欣医学中心完成。将胰岛素样生长因子克隆入复制缺陷性腺病毒穿梭质粒得到含胰岛素样生长因子的腺病毒穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组得到含胰岛素样生长因子的整合质粒,在HEK293A细胞中包装加膜,聚合酶链反应鉴定,大量扩增病毒。将含目的基因的病毒转染C17.2神经干细胞,原位杂交检测胰岛素样生长因子mRNA,蛋白印迹检测胰岛素样生长因子蛋白的表达,酶联免疫吸附实验检测胰岛素样生长因子蛋白的表达曲线。结果:经酶切鉴定及聚合酶链反应鉴定证实腺病毒载体构建正确。原位杂交检测到胰岛素样生长因子mRNA,蛋白印迹分析检测到胰岛素样生长因子蛋白在转染了重组腺病毒的C17.2神经干细胞内表达。酶联免疫吸附实验结果显示胰岛素样生长因子蛋白在病毒转染5～7d达高峰,13d仍高于转染前。结论:成功构建了含胰岛素样生长因子的重组腺病毒载体,转染了该腺病毒的C17.2神经干细胞可稳定表达胰岛素样生长因子。

转化生长因子-β3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:构建含有转化生长因子-β3(Transforming growth factor-β3,TGF-β3)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体,使其转染兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),并在细胞内得到表达。方法:将含有TGF-β3基因克隆至含有EGFP的穿梭质粒,通过在感受态菌DH5α内同源重组,构建pAdxsi-EGFP-TGF-β3。PacⅠ酶切线性化pAdxsi-EGFP-TGF-β3转染HEK293细胞,多轮"乒乓感染法"扩增收集pAdxsi-EGFP-TGF-β3病毒液,氯化铯梯度离心纯化,PCR和荧光显微镜观察EGFP的表达并检测重组腺病毒液的滴度。测定重组腺病毒液转染MSCs细胞转染效率,Western blot检测TGF-β3蛋白表达。结果:成功构建携带TGF-β3和EGFP的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3,PCR和绿色荧光证实病毒包装成功,并具有感染力,病毒滴度为2×1010pfu/ml。Western blot检测表明Adxsi-EGFP-TGF-β3感染的兔骨髓MSCs细胞有效表达TGF-β3。结论:含有TGF-β3和EGFP的腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3构建成功和TGF-β3蛋白在兔骨髓MSCs中有效表达,为进一步研究转染TGF-β3基因的兔骨髓MSCs减轻创面愈合后瘢痕组织增生提供实验基础。

小鼠神经生长因子基因重组腺病毒的构建及其在基底膜上的表达

目的构建具有生物学活性的小鼠神经生长因子(nerveg rowth factor,βNGF)基因重组腺病毒表达载体,并研究其在耳蜗基底膜上的表达特性。方法利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从小鼠颌下腺总mR-NA中扩增βNGF全长cDNA片断,定向克隆于携带巨细胞启动子(CMV)和标记蛋白-绿色荧光蛋白(eGFP)的腺病毒穿梭质粒pAdtrack中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建pAdeasy-1pAd-track-CMV-eGFP-mβNGF;在HEK293细胞中包装成为有感染能力的,能表达βNGF和绿色荧光蛋白的重组腺病毒颗粒。用病毒感染原代培养的耳蜗基底膜,激光共聚焦显微镜下观察病毒感染效率,RT-PCR法检测βNGF基因在基底膜上的转录表达,蛋白质免疫印迹法检测βNGF在基底膜上的蛋白表达。结果成功获得小鼠βNGF的cDNA片断,经酶切鉴定证实重组腺病毒表达载体pAdeasy-1pAdtrack-CMV-eGFP-mβNGF构建成功。激光共聚焦显微镜下观测到感染病毒的基底膜发出明亮的绿色荧光,分别在mRNA和蛋白质水平证实有外源性βNGF的表达。结论重组腺病毒表达载体能高效地将外源性目的基因βNGF导入体外培养的基底膜细胞中,并在基底膜中转录和翻译,为进一步研究腺病毒介导的βNGF对内耳各类细胞的保护作用奠定基础。

腺病毒介导神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白双基因在受损坐骨神经中的表达

背景:神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白能够促进损伤神经的结构与功能恢复,但目前未见通过转基因技术增加受损周围神经中神经生长因子与髓磷脂相关糖蛋白基因表达的报道。目的:探讨神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白双基因经腺病毒介导在大鼠损伤坐骨神经的共表达效果。方法:将40只SD大鼠随机分为正常对照组、坐骨神经损伤组、空病毒组、神经生长因子组和神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组。后4组切断并缝合右侧坐骨神经建立坐骨神经损伤模型后,分别肌肉注射生理盐水、生理盐水、空腺病毒(1×108 PFU/次)、携带神经生长因子的腺病毒(1×108 PFU/次)和携带神经生长因子和髓磷脂相关糖蛋白的腺病毒(1×108 PFU/次),每2 d注射1次,连续注射3次。结果与结论:神经生长因子组和神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组大鼠坐骨神经中神经生长因子表达水平显著高于空病毒组和正常对照组(P<0.05);神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白组大鼠坐骨神经中髓磷脂相关糖蛋白表达水平显著高于空病毒组、神经生长因子组和正常对照组(P<0.05)。提示腺病毒介导的神经生长因子/髓磷脂相关糖蛋白双基因可有效表达于大鼠损伤坐骨神经。

腺病毒介导小鼠神经生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建具有生物学活性的小鼠神经生长因子(nerve growth factor,βNGF)基因重组腺病毒表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞中的表达特性。方法利用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从小鼠颌下腺总mRNA中扩增βNGF全长cDNA片断,定向克隆于携带巨细胞启动子(CMV)和标记蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒穿梭质粒pAdtrack中;在细菌BJ5183中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-mβNGF;在HEK293(人胚肾293细胞)细胞中包装成为有感染能力的、能表达βNGF和绿色荧光蛋白的重组腺病毒颗粒。用病毒感染原代培养的人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem-cells,MSCs),荧光显微镜下观察病毒感染效率,免疫细胞化学法检测细胞中βNGF的蛋白表达,蛋白质免疫印迹法检测培养上清中NGF的分泌。结果成功获得小鼠βNGF的cDNA片断,经酶切鉴定证实重组腺病毒表达载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-mβNGF构建成功。荧光显微镜下观测到感染病毒的细胞胞体发出明亮的绿色荧光,细胞中βNGF免疫染色阳性,培养上清中检测有NGF分泌。结论重组腺病毒表达载体能高效地将外源性目的基因βNGF导入骨髓间充质干细胞中,并能正确转录、翻译和分泌,为骨髓间充质干细胞在内耳基因干预的研究中奠定基础。

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。

外源性神经生长因子激活Wnt3α/β-catenin信号通路促进骨折愈合

目的:分析外源性神经生长因子激活Wnt3α/β-catenin信号通路促进骨折愈合的作用。方法:选取40只SPF级SD大鼠,10只大鼠作为对照组,30只构建胫骨骨折模型,共有27只大鼠建模成功,分为模型组9只、低剂量组9只、高剂量组9只。观察各组大鼠病理组织学、骨钙、骨磷水平、血液流变学指标、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、炎症因子水平、Wnt3α/β-catenin通路关键基因Wnt3a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表达量、Wnt3α/β-catenin通路关键蛋白Wnt3a、β-catenin、GSK-3β的表达。结果:与对照组相比,另外三组骨钙、骨磷、BMD、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量降低,全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量升高,与模型组相比,低、高剂量组骨钙、骨磷、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量升高,全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量降低;且高剂量组体现出最高骨钙、骨磷、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量,最低全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量(P<0.05)。结论:采用外源性神经生长因子对胫骨骨质大鼠干预,可促使大鼠骨折的愈合,其作用机制可能与激活Wnt3α/β-catenin信号通路有关,具有较好的使用效果。

腺病毒介导人肝细胞生长因子对大鼠皮层神经元损伤的保护作用

目的 :探讨腺病毒介导人肝细胞生长因子 (Ad -HGF)对体外无血清培养所致大鼠皮层神经元损伤的保护作用。方法 :用流式细胞仪测定不同感染强度 (MOI)条件下携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒 (Ad GFP) (2 5 ,5 0 ,10 0 ,2 0 0 pfu/cell)对皮层神经元的转染效率 ,确定最佳MOI ;ELISA测定Ad HGF在最佳感染强度下皮层神经元中的表达规律 ;通过中性红染色和PI Hoechst33342双染色法比较转染Ad HGF组与对照组 (转染Ad GFP组和空白对照组 )间无血清培养后 6h、12h、2 4h和 4 8h细胞的存活情况。结果 :在感染强度为 5 0 pfu/cell时 ,重组腺病毒对皮层神经元的转染率达 99.3% ,Ad HGF能在皮层神经元中有效而持久地表达 ,接种后 2h转染Ad HGF组的细胞死亡率和凋亡率在无血清培养后 12h明显低于两对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :Ad HGF对接种后 2h转染组无血清培养所致的损伤有显著的保护作用 ,对接种后第 5d转染的皮层神经元无血清所致的损伤虽亦具有一定的保护作用 ,但不明显。

肾结石经输尿管软镜碎石术后血清神经导向因子-1、结缔组织生长因子水平对肾损伤的预测价值

目的 探讨血清神经导向因子-1(Netrin-1)、结缔组织生长因子(CTGF)对肾结石经输尿管软镜碎石术后肾损伤的预测价值。方法 2020年3月~2022年3月我院收治的肾结石病人104例,均采用经输尿管软镜碎石术治疗,选取同期我院健康体检者98例为对照组。将输尿管软镜碎石术后肾结石病人分为肾损伤组(58例)和非肾损伤组(46例)。使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清Netrin-1、CTGF的表达水平。采用单因素分析及多因素Logistic回归分析肾结石经输尿管软镜碎石术后出现肾损伤的影响因素,采用受试者工作特性(ROC)曲线评估血清Netrin-1、CTGF对肾结石经输尿管软镜碎石术后肾损伤的预测价值。结果 研究组血清Netrin-1、CTGF表达水平均高于对照组;肾损伤组血清Netrin-1、CTGF水平高于非肾损伤组;多因素Logistic回归分析显示,Netrin-1≥300 ng/L、CTGF≥0.80 ng/L是输尿管软镜碎石术后肾损伤的危险因素(P<0.05)。血清Netrin-1、CTGF在预测经输尿管软镜碎石术后肾结石病人发生肾损伤的AUC分别为0.731(95%CI:0.668~0.813)、0.845(95%CI:0.798~0.892),两者联合预测的AUC为0.903(95%CI:0.852~0.955)。结论 血清Netrin-1、CTGF表达水平升高与输尿管软镜碎石术后出现肾损伤密切相关,可作为评估输尿管软镜碎石术后早期肾损伤生物学指标,且两者联合预测的效能更高。

腺病毒介导转化生长因子β1对786-0肾癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨腺病毒介导的转化生长因子β-1(TGF-β1)对肾癌细胞迁移与侵袭的影响。方法将肾癌细胞系786-0细胞培养后分实验组及对照组,实验组以腺病毒为载体将TGF-β1转染,采用细胞划痕实验检测TGF-β1对其迁移的影响;采用Transwell小室实验检测TGF-β1对其侵袭的影响。结果 48 h后实验组的划痕宽度明显变窄,且明显小于对照组(P<0.05);48 h后实验组的穿透细胞数明显多于对照组(P<0.05)。结论 TGF-β1能够促进肾癌细胞的迁移与侵袭。

腺病毒介导的神经生长因子对小鼠宫颈癌的作用

为观察腺病毒介导的神经生长因子对宫颈癌小鼠的作用效果,采用U14细胞注射建立宫颈癌小鼠模型,腺病毒介导的人神经生长因子瘤周注射2次,每周1次。结果表明,体外试验表明腺病毒介导的神经生长因子对癌细胞有一定的抑制作用,能引起细胞凋亡。体内试验表明腺病毒介导的神经生长因子的用量低于1×107PFU时,对宫颈癌的抑制率和免疫器官指数的影响均呈线性升高趋势;在用量为1×107PFU时,抑瘤率最高,达到50.89%;而当腺病毒介导的神经生长因子用量达到1×108PFU时,抑瘤率降低为-0.13%。

重组人神经生长因子β基因腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达人神经生长因子β基因片段的重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。方法以健康人白细胞中DNA为模板,扩增h NGF-β基因片段,导入p GEM-T-Easy质粒,获得重组质粒p GEM-T/h NGF-β。经酶切鉴定后与复制缺陷型腺病毒穿梭质粒p ACCMV-p Lp A构建重组腺病毒穿梭质粒p ACCMV-h NGF-β。酶切鉴定后再与辅助包装质粒PJM17共转染293细胞,经同源重组后,构建复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。对Ad CMV-h NGF-β进行基因鉴定,并测定滴度及在He La细胞中的表达。结果顺利克隆出h NGF-β基因片段,构建的重组质粒p GEM-T/h NGF-β和重组腺病毒穿梭质粒p ACCMVh NGF-β,经酶切鉴定实际结果与理论推导符合。构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β滴度为1.2×1012pfu/ml,并能在He La细胞中表达。结论以h NGF-β基因片段为基础成功构建了重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β,测试表明该重组病毒具有高滴度活性和良好的感染人类细胞、表达目的蛋白的能力。