人腺病毒36型与肥胖发生相互关系的研究进展

病毒感染与肥胖发生之间关系的研究在近年来受到关注,尤其是人腺病毒36型(Ad-36)感染。Ad-36抗体的存在与肥胖者体质指数增加具有相关性,体外动物模型和细胞模型实验也支持Ad-36诱导肥胖发生。在肥胖发生机制方面,E4 orf-1基因和脂肪细胞分化通路受到关注,磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径被认为在Ad-36引发降血糖作用中发挥重要作用。目前,Ad-36的研究数据仍然有限,其与肥胖发生之间关系的确认需更多的流行病学数据和更深入的研究。

腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞PPARγ和adiponectin基因表达的影响

目的探讨腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ）和脂联素（adiponectin）基因表达的影响。方法无菌条件下获取人皮下脂肪组织、I型胶原酶消化并收集人脂肪源性间充质干细胞（human adipose-derived mesenchymal stem cell,h AMSC）,细胞传至第3代（P3代）对h AMSC进行定向成脂诱导,并进行油红O染色;流式细胞仪检测h AMSC表面免疫表型;人类腺病毒36（adenouirus-36,Ad36）感染h AMSC,采用荧光实时定量PCR（Real time-PCR）方法检测Ad36感染的h AMSC PPARγ和adiponectin基因表达的变化规律。结果 （1）h AMSC在体外呈梭形生长,且能稳定传代;（2）细胞在加入成脂诱导剂后可定向分化成脂肪细胞;（3）流式细胞术检测结果显示h AMSC免疫表型：CD105（93.0±1.3）%,CD44（99.6±0.3）%,CD34（0.2±0.1）%,CD45（0.2±0.3）%,CD31（0.3±0.3）%,CD29（3.4±0.2）%;（4）Ad36感染h AMSC后细胞内脂滴逐渐增多、增大。PPARγ和adiponectin基因在Ad36感染h AMSC后的第1天开始表达,感染后第2～6天较0 MOI组显著升高（P〈0.05）,至感染后第8天10 MOI剂量组表达水平开始下降。结论 Ad36使h AMSC定向分化成脂肪细胞,并上调了PPARγ和adiponectin基因的表达。

人腺病毒36型在3T3-L1脂肪细胞棕色化过程中的作用

目的探讨人腺病毒36型(Ad36)在诱导3T3-L1脂肪细胞棕色化过程中的作用。方法(1)采用经典的鸡尾酒诱导法(MDI)将3T3-L1前脂肪细胞定向成脂诱导分化至第4天,然后将已经分化的3T3-L1脂肪细胞分为MDI组、MDI+Rapa组、MDI+Ad36组以及MDI+Rapa+Ad36组,并将继续分化至第8天的细胞行氟化硼二吡咯染色,观察细胞内脂滴大小与成脂情况;(2)实时荧光定量PCR检测4组细胞中棕色脂肪标记基因过氧化物酶体增殖物活化受体共激活因子1α(pgc1α)、解偶联蛋白1(ucp1)、成纤维生长因子21(fgf21),线粒体相关酶基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA表达水平;(3)Western blot分别检测上述基因蛋白质表达水平。结果(1)在3T3-L1脂肪细胞分化的第8天,MDI与MDI+Rapa组细胞内均出现较多且大的脂滴;与MDI组相比,MDI+Ad36组脂滴减小;与MDI+Ad36组相比,MDI+Ad36+Rapa组脂滴略有增大。(2)与MDI组相比,MDI+Ad36组棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21,线粒体相关酶基因atp5o、cox5b、nd2基因mRNA表达水平显著升高,在加入Rapa后,上述基因mRNA表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)与MDI组相比,MDI+Ad36组PGC1α、UCP1、FGF21、ATP5O、COX5B、ND2以及磷酸化mTOR蛋白质表达水平均显著升高(P<0.05),在加入Rapa后,上述蛋白质表达水平均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad36可能通过mTOR上调pgc1α的表达,并进一步使ucp1、fgf21、atp5o、cox5b、nd2的基因表达水平升高,加快甘油三酯的分解与线粒体氧化磷酸化,使3T3-L1脂肪细胞棕色化。

维吾尔族及汉族患者人腺病毒36感染与肥胖低密度脂蛋白关系研究

目的了解新疆某三甲医院维吾尔族、汉族患者人腺病毒36(HAd V-36)感染与肥胖、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的关系。方法对2013年6月至2014年10月新疆医科大学第一附属医院内科132例维吾尔族、汉族入院检查的患者进行调查,并测定HAd V-36感染率,按体重指数(BMI)、LDL-C水平分组分析。结果BMI<25(正常组)、25≤BMI<28(超重组)、BMI≥28(肥胖组)HAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为6.88%、21.87%、36.59%(P<0.05);其中维吾尔族BMI<25、25≤BMI<28、BMI≥28 HAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为4.76%、27.78%、36.60%(P<0.05);汉族BMI<25、25≤BMI<28、BMI≥28 HAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为7.89%、14.29%、37.50%(P<0.05),但不同的BMI组维族及汉族比较病毒检出率差异无统计学意义(P>0.05)。LDLC<3.37mmol/L、LDL-C≥3.37 mmol/L组HAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为12.20%,32%(P<0.05);其中维吾尔族LDL-C<3.37 mmol/L、LDL-C≥3.37 mmol/LHAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为15%、37.50%(P<0.05);汉族LDL-C<3.37 mmol/L、LDL-C≥3.37 mmol/LHAd V-36病毒抗体阳性检出率分别为9.52%、26.93%(P<0.05)。但不同的LDL组维族及汉族病毒检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAd V-36病毒感染与新疆维吾尔族及汉族肥胖、LDL密切相关,随着BMI指数的增加,HAd V-36病毒检出率越高;且LDL-C水平越高,HAd V-36病毒检出率越高。

腺病毒36型对PPARγ和CIDEC在脂肪细胞分化过程的调节作用

为探讨腺病毒36型在人脂肪细胞分化过程中对PPARγ及CIDEC基因表达的调节作用,利用腺病毒感染人脂肪源性间充质干细胞(h AMSC)、油红O染色和RT-q PCR鉴定Ad36诱导h AMSC分化为脂肪细胞模型;葡萄糖氧化酶法和甘油三酯终点法测定人类腺病毒36型(Ad36)诱导h AMSC分化为脂肪细胞的过程中培养基葡萄糖浓度及细胞甘油三酯含量;RT-q PCR、Western Blotting方法检测Ad36诱导的人脂肪细胞中,PPARγ和CIDEC蛋白表达水平的变化;用PPARγ特异性抑制剂GW9662抑制PPARγ表达后,Western Blotting方法检测Ad36诱导的人脂肪细胞中CIDEC蛋白质的表达。Ad36诱导的h AMSC定向分化成人脂肪细胞,分化过程中培养基葡萄糖含量较对照组显著降低(P<0.05),细胞内甘油三酯含量较对照组显著升高(P<0.05),PPARγ和CIDEC基因表达水平较对照组显著升高(P<0.05),在诱导第6天表达水平最高,在使用GW9662抑制PPARγ蛋白质表达后,CIDEC蛋白质表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。从细胞水平证实,Ad36诱导人脂肪细胞分化过程中,Ad36通过PPARγ上调CIDEC基因的表达水平。

学龄前儿童腺病毒36型检测及其与体质指数和血压的关系

目的研究学龄前儿童肠道内腺病毒36型(Ad-36)的存在情况,及其与体质指数和血压的关系。方法从2013年1月-2014年10月,在就诊的学龄前儿童中随机抽取肥胖儿童33例,体重正常儿童38例,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测新鲜粪便中的Ad-36,并测量儿童的体重、身高和血压。整个过程采用双盲法进行检测及测量。结果在71例儿童中,Ad-36阳性的有36例,平均年龄(4.36±0.74)岁,男20例,阳性率为50.7%;阴性的有35例,平均年龄(4.56±0.39)岁,男16例,阴性率为49.3%;阳性组和阴性组性别、年龄差别无统计学意义(P>0.05);阳性组和阴性组的肥胖率分别为69.4%和29.6%(P<0.05);两组的体质指数(BMI)分别为(19.27±2.55)和(16.38±2.13)kg/m2(P<0.05);血压分别为(103.06±11.40)/(68.58±8.12)mm Hg和(95.37±5.40)/(60.26±4.04)mm Hg(P<0.05)。结论学龄前儿童肠道Ad-36的感染与体质指数和血舒张压升高有一定的相关性,并提示与肥胖的发生有一定的影响。

36型人腺病毒腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)的原核表达及多克隆抗体制备

目的利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得E4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体。方法根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序。将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至E.coliBL21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达和纯化。将纯化获得的重组蛋白免疫新西兰白兔,在5次免疫后分离血清,ELISA检测抗体效价。抗原亲和纯化出E4ORF1多克隆抗体,Western blot法检测抗体的特异性。结果成功扩增E4ORF1基因,经测序比对与GenBank序列一致,大小为408 bp,证明成功构建原核重组表达质粒。经鉴定重组蛋白的相对分子质量(M_(r))约14000,ELISA检测5次免疫后兔血清抗体效价达1∶320000。Western blot法证明该抗体具较高的特异性。结论成功表达E4ORF1蛋白,并制备了高特异性的兔抗E4ORF1多克隆抗体。

36型人腺病毒E4ORF1真核表达载体的构建及其促进前脂肪细胞3T3-L1对葡萄糖利用的作用初探

目的通过构建早期基因4开放读码框1(E4ORF1)真核表达载体,探讨E4ORF1蛋白调节前脂肪细胞3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)利用葡萄糖的作用。方法通过分子克隆技术构建pcDNA3.1-E4ORF1重组质粒,并进行DNA测序鉴定。将前脂肪细胞3T3-L1分为对照组和E4ORF1转染组,检测两组细胞第0、1、2、3天培养基中葡萄糖浓度,利用RT-qPCR和Western-Blot检测两组细胞第0、1、2、3、4天E4ORF1、己糖激酶2(HK2)、糖原合酶1(GYS1)mRNA和蛋白质的表达情况。油红O染色观察两组细胞第0、1、2、3、4天分化及脂质积累情况,检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白a(C/EBPa)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA和蛋白质的表达情况。结果成功构建N端带FLAG(DYKDDDDK肽)标签的真核表达载体pcDNA3.1-E4ORF1。与对照组相比,E4ORF1转染组细胞培养基中葡萄糖浓度随培养时间延长下降更快,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-qPCR和Western-Blot结果显示,与对照组相比,转染组E4ORF1的mRNA和蛋白表达水平均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。E4ORF1转染组的糖酵解关键酶基因HK2和糖原合酶基因GYS1 mRNA和蛋白质的表达均显著上升(P均<0.05)。油红O染色显示两组细胞均无成脂分化现象,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPa、FABP4、FASN、ACC的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。结论成功构建pcDNA3.1-E4ORF1真核表达载体;在前脂肪细胞3T3-L1中,E4ORF1可能通过促进HK2和GYS1的表达,参与细胞对葡萄糖的分解和糖原合成过程,对前脂肪细胞的分化无影响。

腺病毒感染及肥胖基因突变在肥胖发病中的作用

采用流行病学研究方法,应用分子病毒学技术,研究我国南方肥胖人群腺病毒36型(AD-36)的感染情况,同时结合分子生物学技术分析并比较正常及肥胖群体代谢相关基因解偶联蛋白(UCP)、β3肾上腺素能受体(β3-AR)的基因多态性,检测人群瘦素及蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)含量、活性,辅以问卷调查生活方式等,综合遗传、内分泌、环境等因素,全面评价AD-36在致我国人群肥胖发生中的作用,为探明肥胖病因及防治方法提供依据。

Ad36感染对维吾尔族肥胖患者progranulin表达的调节作用

目的探讨腺病毒36型(Ad36)感染对维吾尔族肥胖患者颗粒蛋白前体(progranulin)表达的调节作用。方法根据肥胖诊断标准将维吾尔族人群样本分为肥胖组(115)与非肥胖组(117),收集血清标本232份,脂肪标本102份。血清中和反应法检测样本血清中的Ad36抗体。采用实时荧光定量PCR(real time quantitative-PCR)方法检测研究对象大网膜和皮下的脂肪组织progranulin的mRNA表达水平,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清progranulin的蛋白表达水平。免疫组化方法检测脂肪组织巨噬细胞CD68蛋白表达,了解巨噬细胞浸润情况。结果 1肥胖患者Ad36感染率(54/115,47.0%)明显高于非肥胖者(38/117,32.5%),差异有统计学意义(P<0.05)。2Ad36感染的肥胖组血清progranulin的蛋白表达水平(408.45±156.92)显著高于非肥胖组(326.11±158.60),差异有统计学意义(P<0.05);两组的腹部大网膜、皮下脂肪组织progranulin mRNA表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。3Ad36感染的肥胖组巨噬细胞浸润(14 730.16±2 227.39)明显高于非肥胖组(10 786.50±2 772.80),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad36感染可能与维吾尔族肥胖发生有关,其机制可能为通过调节血清progranulin的蛋白表达水平而实现。

Ad36-Exosome改善脂肪细胞和肝细胞胰岛素抵抗的作用

研究腺病毒36型(Ad36)感染的人脂肪源性间充质干细胞(hADSC)分泌的外泌体(Exosome)对肝细胞和脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。方法 培养人脂肪源性间充质干细胞(hADSC),用鸡尾酒法诱导成脂,油红O染色检测其定向分化为成熟脂肪细胞的能力。用5MOI Ad36感染hADSC后提取外泌体。电镜检测和NTA实验鉴定外泌体大小,采用western-blot的方法检测外泌体标记基因TSG101、CD9、CD63、CD81鉴定外泌体。用Ad36感染的hADSC分泌的外泌体干预肝细胞和脂肪细胞,利用葡萄氧化酶法检测第0、2、4、6、8天培养基中葡萄糖的含量,并以培养皿中细胞总蛋白的含量进行校正。结果 油红O染色结果显示,hADSC可以定向诱导为成熟的脂肪细胞。Ad36可以诱导A549细胞形成细胞病变效应。Ad36感染hADSC细胞后脂肪细胞内甘油三酯合成增多。电镜实验和NTA实验结果显示,分离得到的Ad36感染hADSC细胞分泌的外泌体大小在100nm左右。Western-blot检测外泌体标记基因结果显示外泌体提取成功。外泌体干预肝细胞和脂肪细胞后的第2、4、6、8天与第0天未干预组相比,培养基葡萄糖浓度降低且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad36可能通过外泌体来增加肝细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取,进而改善胰岛素抵抗的作用。

LncRNAROR对Ad36诱导人脂肪源性干细胞棕色化的作用

目的探讨LncRNA ROR在腺病毒36型（Ad36）诱导的人脂肪源性干细胞棕色化过程中的作用。方法对鸡尾酒法诱导组和Ad36诱导组第2、4、6、8天细胞进行油红O染色，观察人脂肪源性干细胞（hADSC）成脂情况，采用实时定量PCR方法检测2组LncRNA ROR、解耦联蛋白1（UCP1）及PRDM16的mRNA表达水平，Western印迹法检测UCP1及PRDM16的蛋白表达水平。siRNA干扰LncRNA ROR后，实时定量PCR和Western印迹法分别检测Ad36诱导脂肪细胞分化过程中干扰组与对照组UCP1及PRDM16的mRNA和蛋白表达水平。结果油红O染色结果显示，鸡尾酒诱导组的脂肪细胞中脂滴较大，而Ad36诱导组则为颗粒状较小脂滴。与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组LncRNA ROR、UCP1及PRDMl6的mRNA表达水平及UCP1和PRDM16蛋白表达水平显著升高（P〈0．05）。与对照组相比，LncRNA ROR干扰组UCP1及PRDMl6的mRNA及蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）。结论Ad36诱导hADSC分化过程中．上调的LncRNA ROR可能通过正向调控UCP1及PRDM16表达，从而促进hADSC的棕色化。

Ad36诱导3T3-L1细胞棕色化的作用研究

目的探讨腺病毒36型(Ad36)在诱导3T3-L1细胞棕色化过程中的作用。方法对鸡尾酒法诱导组(对照组)和鸡尾酒加Ad36诱导组(实验组)第0、2、4、6、8天3T3-L1细胞进行BODIPY染色,观察细胞成脂情况;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测2组解耦联蛋白1(Ucp1)、ATP合成酶O亚基(Atp5o)、细胞色素c氧化酶亚基5B(Cox5b)、周脂素(Perilipin)的mRNA与蛋白表达水平。结果BODIPY染色结果显示,随着诱导天数的增加,对照组脂肪细胞内脂滴呈现出由小到大的动态变化,而实验组细胞内脂滴先增大,在第4天加入Ad36后脂滴变小。与对照组相比,实验组Ucp1、Atp5o、Cox5b mRNA和蛋白表达水平显著升高,Perilipin mRNA和蛋白表达水平则明显下降(P<0.05)。结论在3T3-L1细胞分化过程中,Ad36通过正向调控Ucp1、Atp5o、Cox5b基因表达促进3T3-L1细胞棕色化。