基于缺氧诱导因子-1α/Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3通路探讨速效救心丸对冠心病大鼠的保护机制

目的探究速效救心丸对冠心病大鼠的保护作用,初步探究其可能作用机制。方法将40只SD大鼠分为健康组、单纯模型组、速效救心丸组、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)激活剂奥替普拉(Oltipraz)组、速效救心丸+奥替普拉组,每组10只大鼠。对大鼠心电图ST段、T波变化进行检测,采用酶法测定一氧化氮及血脂指标总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)、前列环素I2(PGI2)水平,HE染色观察心肌组织病理形态学变化情况;DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL法)检测心肌组织细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测心肌组织中HIF-1α、Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氮酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达。结果与健康组相比,单纯模型组ST段(0.36±0.05)mV、T波(0.26±0.05)mV升高,三酰甘油(1.08±0.14)mmol/L、总胆固醇升高,HDL(0.59±0.05)mmol/L降低,TNF-α(38.27±1.36)pg/mL、ET-1(11.63±1.84)ng/L升高,一氧化氮(28.58±1.53)μmol/L降低,心肌组织细胞凋亡率(46.72±4.37)%升高,HIF-1α(1.12±0.15)、caspase-3(0.54±0.05)蛋白表达升高,Bcl-2(0.36±0.05)蛋白表达降低(P<0.05)。速效救心丸组ST段(0.23±0.04)mV、T波(0.15±0.04)mV、三酰甘油(0.85±0.07)mmol/L、TNF-α(24.69±1.53)pg/mL、ET-1(7.18±1.57)ng/L、细胞凋亡率(15.66±3.51)%、HIF-1α(0.49±0.06)、caspase-3(0.42±0.04)蛋白表达低于单纯模型组,一氧化氮(36.43±1.65)μmol/L、Bcl-2(0.67±0.07)高于单纯模型组(P<0.05)。奥替普拉组ST段(0.41±0.05)mV、T波(0.35±0.03)mV、三酰甘油(1.27±0.12)mmol/L、TNF-α(43.42±1.59)pg/mL、ET-1(12.76±1.45)ng/L、细胞凋亡率(62.88±8.35)%、HIF-1α(1.37±0.26)、caspase-3(0.91±0.09)蛋白表达高于单纯模型组,一氧化氮(23.52±1.84)μmol/L、Bcl-2(0.25±0.04)低于单纯模型组(P<0.05)。速效救心丸+奥替普拉组ST段(0.34±0.06)mV、T波(0.24±0.05)mV、三酰甘油(1.06±0.13)mmol/L、总胆固醇、TNF-α(35.23±1.65)pg/mL、ET-1(11.24±1.73)ng/L、细胞凋亡率(42.76±5.16)%、HIF-1α(1.06±0.17)、caspase-3(0.52±0.06)蛋白表达低于奥替普拉组,一氧化氮(27.24±1.32)μmol/L、Bcl-2(0.38±0.06)高于奥替普拉组(P<0.05)。结论速效救心丸可改善冠心病大鼠血脂、内皮功能,降低机体炎症反应,其可能是通过抑制HIF-1α/BNIP3通路、降低心肌细胞凋亡实现的。

腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究

目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。

介导入硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建

目的 应用基因重组方法构建携带人硫氧还蛋白（hTRX）基因的复制缺陷型重组腺病毒。方法 用内切酶、RT-PCR、测序方法获得目的基因片段，然后将其cDNA克隆至表达载体pShuttle构建hTRX的重组真核细胞表达载体pShuttle—hTRX，在HeLa细胞中进行瞬时表达检测。从真核表达载体pShuttle—hTRX切下目的基因，并插入至腺病毒载体构建hTRX的重组腺病毒载体Adeno—hTRX，经PCR方法亦证明了成功构建腺病毒重组体。重组腺病毒在293细胞中扩增、纯化。结果 成功构建了携带人硫氧还蛋白基因的复制缺陷型重组腺病毒，并以多种方法证实了构建载体的正确性。结论 正确构建的人硫氧还蛋白重组腺病毒载体，可为基因治疗心血管系统疾病打下良好基础。

HPV_(16)L1-E7重组病毒及其重组质粒免疫后小鼠抗体水平动态变化的研究

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型L1 E7重组腺病毒 (rAd5HPV16 L1 E7virus)及其重组质粒 (rAd5HPV16 L1 E7plasmid)经不同途径免疫后小鼠抗体水平的动态变化。方法 :用 2 93细胞扩增rAd5HPV16 L1 E7重组病毒 ,同时制备rAd5HPV16 L1 E7重组质粒 ,分别以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠 ,采用ELISA法测定其血清IgG抗体水平。结果 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒采用不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,其中以肌注组产生抗体量最多 ,并且出现最早。结论 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒均能刺激B细胞产生抗体介导的免疫应答 ,免疫途径不同 ,抗体峰值的出现时间亦不同 ,测定抗体的最佳时间亦不同。

溶瘤腺病毒SG611联合顺铂对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用及其机制

目的探讨溶瘤腺病毒SG611联合顺铂(DDP)对肝细胞癌(肝癌)细胞Hep G2的协同杀伤作用及其作用机制。方法利用携带GFP的腺病毒载体SG611感染人肝癌细胞Hep G2,流式细胞术检测SG611感染效率,CCK-8实验检测SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2杀伤效应,结晶紫染色法观察细胞毒性作用;4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法检测细胞凋亡率,Western blot检测E1A蛋白的表达。实验数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果 SG611-EGFP感染肝癌细胞Hep G2荧光显微镜下观察,随着感染复数(MOI)的增加,GFP阳性细胞数目明显增加,流式细胞术检测SG611的感染效率分别为0.18%、6.36%、50.60%、73.20%、86.80%、90.50%,呈剂量依赖性。MOI=10的SG611与1.5μg/ml的DDP联合应用的细胞存活率为(33.2±1.2)%,明显低于单用SG611的(88.8±8.9)%(LSD-t=-7.83,P<0.05);且联合应用对肝癌细胞Hep G2的细胞毒性作用明显强于单用SG611。两者联合应用时肝癌细胞Hep G2凋亡率为(23.9±1.5)%,明显高于单用SG611、DDP的(15.3±1.0)%、(12.4±1.1)%(LSD-t=10.56,21.34;P<0.05);且联合应用时肝癌细胞Hep G2的E1A表达明显增强。结论溶瘤腺病毒SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2具有协同杀伤作用。SG611增加DDP化疗敏感性及DDP增强SG611增殖能力可能为其协同杀伤的作用机制。

沉默CtBP1基因逆转人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR^(+/+))的多药耐药性

目的:探讨短发夹式RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰羧基末端结合蛋白1(C-terminal-binding proteins 1,CtBP1)基因表达是否可以逆转多药耐药基因1(multidrug resistant gene 1,MDR1)介导的人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性。方法:采用脂质体转染法将特异性的shRNA1和shRNA2及非特异性的shRNAHK质粒转染入人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中,RT-PCR法检测各组细胞MDR1基因表达水平,Western印迹法检测各组细胞P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,MTT法测定各组细胞对多柔比星的敏感性变化。结果:RT-PCR结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞中MDR1基因被抑制,基因表达抑制率约50%;Western印迹结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞P-gp蛋白的表达水平显著降低;MTT检测发现,shRNA转染48和72h时shRNA1组和shRNA2组细胞对多柔比星的敏感性增加(P<0.01)。结论:沉默CtBP1基因可抑制人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,降低细胞的耐药性。

BNIP3介导的线粒体自噬对低氧环境下卵巢癌HO-8910PM细胞侵袭转移的影响

目的探讨常氧及低氧条件下卵巢癌HO-8910PM细胞线粒体外膜蛋白B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)的表达变化及其对线粒体自噬和细胞侵袭转移的影响。方法将人高转移性卵巢癌细胞株HO-8910PM分为常氧组、低氧组、低氧+BNIP3 siRNA组,各组细胞处理48 h后,应用吖啶橙染色及透射电镜观察细胞线粒体自噬的变化;划痕实验及Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的改变;实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot分析BNIP3、自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的基因及蛋白表达变化。结果在低氧条件下,吖啶橙染色结果显示HO-8910PM细胞线粒体自噬率显著增加,透射电镜结果显示HO-8910PM细胞线粒体自噬小体显著增多(P<0.01)。转染BNIP3 siRNA后细胞线粒体自噬、细胞迁移率和侵袭率均显著受抑(P<0.01)。低氧组BNIP3、LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表达明显增高,低氧条件下转染BNIP3 siRNA后BNIP3、LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论在低氧条件下抑制卵巢癌HO-8910PM细胞BNIP3的表达可显著抑制线粒体自噬,降低细胞迁移和侵袭能力。

E1B缺失腺病毒H101的研究进展

E1B缺失腺病毒H101是采用基因重组技术对人5型腺病毒进行基因重组得到的一种溶瘤腺病毒,它主要是删除了人5型腺病毒的E1B-55×10~3和E3区19×10~3基因片段,具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。

BNIP3与LC3B在椎间盘退行性变过程中的作用

目的研究BCL2/腺病毒E1B19k Da相互作用蛋白3(BNIP3)基因及微管相关蛋白轻链3B(LC3B)基因在退变椎间盘中的表达情况,探讨其与椎间盘退行性变分级之间的相关性。方法收集2016年4月—2016年7月因腰椎椎间盘突出症于本院接受手术治疗的21例患者的退变腰椎椎间盘标本25个,依据Pfirrmann分级分成5组,分别采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹法检测BNIP3、LC3B的m RNA和蛋白表达量,用实时荧光定量PCR技术检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达量,并分析BNIP3表达量、LC3B表达量、细胞自噬、细胞凋亡与Pfirrmann分级之间的关系。结果退变椎间盘组织中BNIP3、LC3B在mRNA和蛋白水平的表达均随椎间盘退行性变程度加重而减少。Bcl-2 m RNA的表达随椎间盘退行性变程度加重而减少,Bax与Casepase-3 mRNA的表达随椎间盘退行性变程度加重而增多。结论随着椎间盘退行性变程度的加重,BNIP3与LC3B的表达减少,组织内细胞凋亡水平升高,细胞自噬对组织的保护作用逐渐下降。提示BNIP3与LC3B在腰椎椎间盘退行性变过程中具有重要的调节作用,可能是细胞自噬和凋亡之间的桥梁蛋白。

缺氧诱导因子-1α和BNIP3在喉癌组织中的表达及相关性研究

目的:检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和BNIP3在喉癌组织中的表达及相关性。方法:采用SP免疫组织化学方法对45例喉癌组织、12例癌旁正常黏膜组织中HIF-1α和BNIP3的表达进行检测。结果:HIF-1α、BNIP3表达于细胞质及细胞核,喉癌组织中的HIF-1α和BNIP3的表达高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05),并且两者的表达呈正相关(P<0.05)。结论:HIF-1α与BNIP3在喉癌中的高表达密切相关。两者的高表达在喉癌的发生发展中可能具有重要作用,HIF-1α可能诱导BNIP3的表达,针对HIF-1α和BNIP3的靶向治疗有望成为新的治疗方法。