腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究

目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。

基于缺氧诱导因子-1α/Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3通路探讨速效救心丸对冠心病大鼠的保护机制

目的探究速效救心丸对冠心病大鼠的保护作用,初步探究其可能作用机制。方法将40只SD大鼠分为健康组、单纯模型组、速效救心丸组、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)激活剂奥替普拉(Oltipraz)组、速效救心丸+奥替普拉组,每组10只大鼠。对大鼠心电图ST段、T波变化进行检测,采用酶法测定一氧化氮及血脂指标总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)、前列环素I2(PGI2)水平,HE染色观察心肌组织病理形态学变化情况;DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL法)检测心肌组织细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测心肌组织中HIF-1α、Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氮酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达。结果与健康组相比,单纯模型组ST段(0.36±0.05)mV、T波(0.26±0.05)mV升高,三酰甘油(1.08±0.14)mmol/L、总胆固醇升高,HDL(0.59±0.05)mmol/L降低,TNF-α(38.27±1.36)pg/mL、ET-1(11.63±1.84)ng/L升高,一氧化氮(28.58±1.53)μmol/L降低,心肌组织细胞凋亡率(46.72±4.37)%升高,HIF-1α(1.12±0.15)、caspase-3(0.54±0.05)蛋白表达升高,Bcl-2(0.36±0.05)蛋白表达降低(P<0.05)。速效救心丸组ST段(0.23±0.04)mV、T波(0.15±0.04)mV、三酰甘油(0.85±0.07)mmol/L、TNF-α(24.69±1.53)pg/mL、ET-1(7.18±1.57)ng/L、细胞凋亡率(15.66±3.51)%、HIF-1α(0.49±0.06)、caspase-3(0.42±0.04)蛋白表达低于单纯模型组,一氧化氮(36.43±1.65)μmol/L、Bcl-2(0.67±0.07)高于单纯模型组(P<0.05)。奥替普拉组ST段(0.41±0.05)mV、T波(0.35±0.03)mV、三酰甘油(1.27±0.12)mmol/L、TNF-α(43.42±1.59)pg/mL、ET-1(12.76±1.45)ng/L、细胞凋亡率(62.88±8.35)%、HIF-1α(1.37±0.26)、caspase-3(0.91±0.09)蛋白表达高于单纯模型组,一氧化氮(23.52±1.84)μmol/L、Bcl-2(0.25±0.04)低于单纯模型组(P<0.05)。速效救心丸+奥替普拉组ST段(0.34±0.06)mV、T波(0.24±0.05)mV、三酰甘油(1.06±0.13)mmol/L、总胆固醇、TNF-α(35.23±1.65)pg/mL、ET-1(11.24±1.73)ng/L、细胞凋亡率(42.76±5.16)%、HIF-1α(1.06±0.17)、caspase-3(0.52±0.06)蛋白表达低于奥替普拉组,一氧化氮(27.24±1.32)μmol/L、Bcl-2(0.38±0.06)高于奥替普拉组(P<0.05)。结论速效救心丸可改善冠心病大鼠血脂、内皮功能,降低机体炎症反应,其可能是通过抑制HIF-1α/BNIP3通路、降低心肌细胞凋亡实现的。

人Dickkopf1基因腺病毒载体的构建及感染黑色素瘤后β-catenin表达的研究

目的构建高表达外源性Dickkopf1(DKK1)基因的重组腺病毒载体(Ad-DKK1);感染黑色素瘤细胞株后研究Wnt信号通路中主要信号分子β-catenin的表达变化。方法利用PCR技术扩增目的基因DKK1;应用分子克隆技术和AdEasy系统重组腺病毒技术,把目的基因亚克隆到穿梭质粒;经酶切和测序后,在BJAdeasy中同源重组;用PacⅠ酶切过的重组腺病毒DNA在HEK293中包装并扩增;实验分为5组:Ad-DKK1感染组、Ad-SimDKK1感染组、Ad-GFP感染组、Ad-RFP感染组和空白细胞对照组。按照MOI值为80感染恶性黑色素瘤细胞株A375,观察细胞形态;RT-PCR法检测DKK1、β-catenin基因的表达,MTT法检测细胞活力。结果重组腺病毒Ad-DKK1经酶切鉴定与测序证实构建成功。感染A375细胞,感染率均大于80%,感染后细胞形态无明显改变。Ad-DKK1感染组DKK1的表达水平(1.638±0.067)与其他4组(0.718±0.086、1.424±0.125、1.414±0.089、1.423±0.088)比较差异具有统计学意义(P<0.05),其β-catenin的表达水平(0.590±0.011)与其他4组(0.895±0.012,0.749±0.024,0.754±0.012,0.759±0.014)比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。MTT法检测细胞活力:Ad-DKK1感染组(0.370±0.014)与其他4组(0.412±0.017、0.398±0.006、0.395±0.007、0.426±0.016)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建重组腺病毒Ad-DKK1,经其感染的恶性黑色素瘤细胞中DKK1的表达明显增强,β-catenin的表达显著降低,A375的细胞活力受到抑制。

介导入硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建

目的 应用基因重组方法构建携带人硫氧还蛋白（hTRX）基因的复制缺陷型重组腺病毒。方法 用内切酶、RT-PCR、测序方法获得目的基因片段，然后将其cDNA克隆至表达载体pShuttle构建hTRX的重组真核细胞表达载体pShuttle—hTRX，在HeLa细胞中进行瞬时表达检测。从真核表达载体pShuttle—hTRX切下目的基因，并插入至腺病毒载体构建hTRX的重组腺病毒载体Adeno—hTRX，经PCR方法亦证明了成功构建腺病毒重组体。重组腺病毒在293细胞中扩增、纯化。结果 成功构建了携带人硫氧还蛋白基因的复制缺陷型重组腺病毒，并以多种方法证实了构建载体的正确性。结论 正确构建的人硫氧还蛋白重组腺病毒载体，可为基因治疗心血管系统疾病打下良好基础。

HPV_(16)L1-E7重组病毒及其重组质粒免疫后小鼠抗体水平动态变化的研究

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型L1 E7重组腺病毒 (rAd5HPV16 L1 E7virus)及其重组质粒 (rAd5HPV16 L1 E7plasmid)经不同途径免疫后小鼠抗体水平的动态变化。方法 :用 2 93细胞扩增rAd5HPV16 L1 E7重组病毒 ,同时制备rAd5HPV16 L1 E7重组质粒 ,分别以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠 ,采用ELISA法测定其血清IgG抗体水平。结果 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒采用不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,其中以肌注组产生抗体量最多 ,并且出现最早。结论 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒均能刺激B细胞产生抗体介导的免疫应答 ,免疫途径不同 ,抗体峰值的出现时间亦不同 ,测定抗体的最佳时间亦不同。

乳腺浸润性癌中E2F1和P16蛋白的表达及意义

目的探讨转录因子E2F1和P16蛋白在乳腺浸润性癌中的表达及其对乳腺癌发生、发展及预后评估的意义,并为乳腺癌的靶向治疗提供一定的依据。方法采用免疫组织化学方法检测61例乳腺浸润性癌、49例导管内乳头状瘤及58例乳腺增生组织中E2F1和P16蛋白的表达情况。结果 E2F1在乳腺浸润性癌、导管内乳头状瘤及乳腺增生组织中的阳性率分别为78.7%、12.2%和1.7%,前者与后二者分别比较差异有统计学意义(P<0.05);P16在乳腺浸润性癌、导管内乳头状瘤及乳腺增生组织中的阳性率分别为34.4%、57.1%和70.7%,前者与后二者分别比较差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织中E2F1和P16阳性表达与患者年龄及肿瘤TNM分期差异无统计学意义(P>0.05),与淋巴结转移及组织学分级差异有统计学意义(P<0.05),E2F1和P16蛋白在癌组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示,呈显著负相关性(r=-0.297,P<0.05)。结论 E2F1、P16蛋白可能参与了乳腺癌的发生和发展,E2F1蛋白的阳性表达与P16失表达可能是患者预后差的指标,二者联合检测更有利于评估预后,同时可为乳腺癌新的生物靶向治疗提供依据。

骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α修复激素性股骨头缺血性坏死

背景:骨形态发生蛋白2是目前发现的唯一的一种可单独诱导骨形成的生长因子,但是研究发现骨形态发生蛋白2单一基因的促血管生成作用较弱,无法在新生骨组织处产生足量的毛细血管,所以在诱导骨形成过程中还需要与其他诱导因子协同作用。低氧诱导因子1α在促进新生血管的形成方面有重要作用。目的:观察腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α(Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu))转染骨髓间充质干细胞对激素性股骨头缺血性坏死的修复作用。方法:(1)转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)到骨髓间充质干细胞,检测碱性磷酸酶活性、钙结节茜素红染色检测其成骨能力;(2)建立激素性股骨头缺血性坏死兔模型,随机分为3组:实验组股骨坏死部位移植转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)的骨髓间充质干细胞;对照组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白组移植细胞培养液。移植8周后,Westen blot法检测骨形态发生蛋白2和低氧诱导因子1α蛋白表达;苏木精-伊红染色组织学观察股骨头缺血性坏死修复情况;墨汁灌注透明切片血管形态学观察股骨头缺损区域血管生成情况。结果与结论:(1)转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和钙结节数量均高于未转染的细胞,说明转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化;(2)实验组骨形态发生蛋白2和低氧诱导因子1α蛋白表达高于对照组与空白组(P<0.05);移植8周后,实验组缺损区周边观察到明显的成骨反应,与对照组及空白组相比,实验组空骨陷窝率低(P<0.05),骨小梁面积百分比高(P<0.05);墨汁灌注实验显示:实验组出现血管化现象,并出现骨陷窝结构,血管间有清晰的连通脉络相互间构成网络,股骨头下血管分布及血管网的形成基本正常,实验组墨汁灌注血管面积为114.22±3.78,高于对照组(63.78±2.61)和空白组(21.39±3.52),差异有显著性意义(P<0.05);(3)提示:骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α可以促进激素性股骨头缺血性坏死的修复。

组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择

背景:血管舒缓素即组织激肽释放酶1,是组织激肽释放酶-激肽系统重要组成部分之一。有研究表明血管舒缓素通过促进血管新生,抑制心肌炎症产生等发挥其对心血管系统的保护作用,但并未从干细胞诱导分化方面进行探讨。目的:实验利用已构建的腺病毒载体,将其携带的血管舒缓素基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,观察其是否成功转染及转染率如何。方法:以腺病毒作为载体,将目的基因血管舒缓素转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,并采用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐法和流式细胞技术观察病毒对细胞的转染效果,以确定最佳的病毒感染复数。结果与结论:荧光显微镜下观察到腺病毒携带的血管舒缓素目的基因成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上;流式细胞仪结果显示转染率跟病毒感染复数值的大小有关系,当病毒感染复数为150时,转染率为80.8%;四甲基偶氮唑盐法结果提示,病毒感染复数为200时,细胞生长受到明显的抑制。结果证实,腺病毒介导的血管舒缓素能成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,且最佳的病毒感染复数为150。

CYP3A4和CYP1A2及CYP2E1快速免疫印迹检测方法的建立

目的:建立细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)、1A2(CYP1A2)及2E1(CYP2E1)的快速免疫印迹(Western blot)检测方法。方法:培养HepG2细胞并提取总蛋白,饲养大鼠并制备肝组织匀浆液、S9以及微粒体,以4种标本为对象分别以不同的封闭时间、抗体孵育时间和分离胶类型等常规Western blot条件设置A、B、C、D、E及F组用以考察CYP3A4的最佳检测条件;使用Western blot快速孵育仪,分别以不同的Western blot封闭和抗体孵育时间条件设置A、B、C和D、E、F及G、H、I组分别用以考察CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1的最佳检测条件。结果:常规Western blot不同条件下,对CYP3A4的检测中C组检测灵敏度在HepG2、肝微粒体样品检测中高于A、B、D、E及F组(P<0.05),在组织匀浆、S9样品检测中C组检测灵敏度高于A、B、E组(P<0.05);在使用Western blot快速孵育仪孵育条件下,对CYP3A4的检测C组灵敏度在HepG2、肝组织匀浆及S9样品检测中高于A、B组(P<0.05),在肝微粒体样品检测中高于B组(P<0.05);对CYP1A2的各组样品检测中,F组的检测背景干净、条带的均一性均优于D、E组;对CYP2E1检测显示,在肝组织匀浆、S9及肝微粒体样品中I组的检测灵敏度高于G、H组(P<0.05)。结论:与常规检测条件相比,改进后的Western blot封闭孵育方式能够有效地对CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1进行快速检测,缩短了封闭孵育的时间。

溶瘤腺病毒SG611联合顺铂对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用及其机制

目的探讨溶瘤腺病毒SG611联合顺铂(DDP)对肝细胞癌(肝癌)细胞Hep G2的协同杀伤作用及其作用机制。方法利用携带GFP的腺病毒载体SG611感染人肝癌细胞Hep G2,流式细胞术检测SG611感染效率,CCK-8实验检测SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2杀伤效应,结晶紫染色法观察细胞毒性作用;4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法检测细胞凋亡率,Western blot检测E1A蛋白的表达。实验数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果 SG611-EGFP感染肝癌细胞Hep G2荧光显微镜下观察,随着感染复数(MOI)的增加,GFP阳性细胞数目明显增加,流式细胞术检测SG611的感染效率分别为0.18%、6.36%、50.60%、73.20%、86.80%、90.50%,呈剂量依赖性。MOI=10的SG611与1.5μg/ml的DDP联合应用的细胞存活率为(33.2±1.2)%,明显低于单用SG611的(88.8±8.9)%(LSD-t=-7.83,P<0.05);且联合应用对肝癌细胞Hep G2的细胞毒性作用明显强于单用SG611。两者联合应用时肝癌细胞Hep G2凋亡率为(23.9±1.5)%,明显高于单用SG611、DDP的(15.3±1.0)%、(12.4±1.1)%(LSD-t=10.56,21.34;P<0.05);且联合应用时肝癌细胞Hep G2的E1A表达明显增强。结论溶瘤腺病毒SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2具有协同杀伤作用。SG611增加DDP化疗敏感性及DDP增强SG611增殖能力可能为其协同杀伤的作用机制。

腺病毒介导的小鼠可溶性endoglin和可溶性血管内皮生长因子受体-1重组蛋白的构建和功能初步鉴定

目的构建腺病毒介导的小鼠可溶性endoglin（sEng）和可溶性血管内皮生长因子受体-1（sFlt-1）重组蛋白，观察其对内皮细胞管化及滋养细胞迁移的影响。方法提取小鼠胎盘组织总RNA，通过RT—PCR获得sEng和sFlt-1 cDNA，插入到穿梭载体pAdTrack—CMV中，获得pATC-sEng和pATC—sFh-1质粒，转化其至pAdeasy-1受体菌，选阳性克隆转染293A细胞，获得Ad／sEng和Ad／sFlt-1，制备高滴度病毒液。用病毒感染COS7细胞，检测sEng和sFlt-1蛋白表达，并通过成管和划痕实验观察两种蛋白对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）管化和Bewo细胞迁移的影响。结果成功获得sEng和sFlt-1重组腺病毒，其滴度分别为2．2×10^11pfu／ml和2．0X10^11pfu／ml。感染COS7细胞后，sEng和sFlt-1蛋白均较高表达，并能抑制HUVEC管化及Bewo细胞迁移，两者有协同作用。结论构建的腺病毒介导的小鼠sEng和sFlt-1重组蛋白对血管生成和滋养细胞迁移有明显抑制作用。

沉默CtBP1基因逆转人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR^(+/+))的多药耐药性

目的:探讨短发夹式RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰羧基末端结合蛋白1(C-terminal-binding proteins 1,CtBP1)基因表达是否可以逆转多药耐药基因1(multidrug resistant gene 1,MDR1)介导的人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性。方法:采用脂质体转染法将特异性的shRNA1和shRNA2及非特异性的shRNAHK质粒转染入人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中,RT-PCR法检测各组细胞MDR1基因表达水平,Western印迹法检测各组细胞P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,MTT法测定各组细胞对多柔比星的敏感性变化。结果:RT-PCR结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞中MDR1基因被抑制,基因表达抑制率约50%;Western印迹结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞P-gp蛋白的表达水平显著降低;MTT检测发现,shRNA转染48和72h时shRNA1组和shRNA2组细胞对多柔比星的敏感性增加(P<0.01)。结论:沉默CtBP1基因可抑制人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,降低细胞的耐药性。

Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

背景:重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力,将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率。目的:拟将Ad-h BMP-2联合Ad-h TGF-β1转染骨髓间充质干细胞体外成骨诱导,观察二者在成骨过程中的相互关系。方法:以腺病毒Ad Max为基因转移载体,将携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因的高滴度腺病毒感染SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达,通过RT-PCR、ELISA、MTT实验及碱性磷酸酶水平检测等方法鉴定。结果与结论:腺病毒感染骨髓间充质干细胞后RT-PCR可检测出外源基因的表达,MTT实验和碱性磷酸酶活性检测双基因共转染的骨髓间充质干细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性最高。结果表明联合应用Ad-h TGF-β1和Ad-h BMP-2转染可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。

表达人单核细胞趋化蛋白-1基因重组腺病毒的制备

目的制备表达人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)复制缺陷型重组腺病毒。方法RT-PCR法获得人肝组织中MCP-1cDNA片段,与T载体连接后亚克隆至腺病毒穿梭载体的巨细胞病毒启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MCP-1,将其线性化后与pAdEasy-1共转化大肠杆菌B J5183,进行同源重组得到重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,PCR扩增鉴定病毒颗粒。结果MCP-1重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,5 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定MCP-1基因片段。结论MCP-1重组腺病毒载体及相应重组腺病毒颗粒的成功构建和制备,为进一步研究MCP-1的作用及应用MCP-1进行基因治疗奠定了基础。

BNIP3介导的线粒体自噬对低氧环境下卵巢癌HO-8910PM细胞侵袭转移的影响

目的探讨常氧及低氧条件下卵巢癌HO-8910PM细胞线粒体外膜蛋白B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)的表达变化及其对线粒体自噬和细胞侵袭转移的影响。方法将人高转移性卵巢癌细胞株HO-8910PM分为常氧组、低氧组、低氧+BNIP3 siRNA组,各组细胞处理48 h后,应用吖啶橙染色及透射电镜观察细胞线粒体自噬的变化;划痕实验及Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的改变;实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot分析BNIP3、自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的基因及蛋白表达变化。结果在低氧条件下,吖啶橙染色结果显示HO-8910PM细胞线粒体自噬率显著增加,透射电镜结果显示HO-8910PM细胞线粒体自噬小体显著增多(P<0.01)。转染BNIP3 siRNA后细胞线粒体自噬、细胞迁移率和侵袭率均显著受抑(P<0.01)。低氧组BNIP3、LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表达明显增高,低氧条件下转染BNIP3 siRNA后BNIP3、LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论在低氧条件下抑制卵巢癌HO-8910PM细胞BNIP3的表达可显著抑制线粒体自噬,降低细胞迁移和侵袭能力。

Bcl2相互作用蛋白3在子宫内膜组织中的表达及其在子宫内膜异位症发病中的意义

目的探究Bcl2相互作用蛋白3(BCL2 Interacting Protein 3,BNIP3)表达变化与正常子宫内膜周期的关系及在子宫内膜异位症(EMs)发病中的意义。方法从GEO数据库获得GSE51981、GSE6364、GSE4888、GSE25628的基因表达谱,通过生物信息学手段比较正常子宫内膜周期组增殖期到分泌期基因表达变化,分析基因富集情况以及BNIP3在正常子宫内膜月经周期中的表达变化;比较数据集中正常子宫内膜周期组人群与内异症病人差异趋势表达基因以及各样本中BNIP3的表达,总结其在EMs发病中的意义;取23例Ⅲ⁃ⅣEMs病人正位及异位子宫内膜组织,以及25例因子宫肌瘤行子宫切除术病人的子宫内膜组织作为正常对照,通过实时荧光定量qRT⁃PCR及蛋白质印迹法(Western Blot)检测BNIP3在各组织中的表达,验证BNIP3表达变化同EMs发病的关系。结果GSE4888、GSE6364、GSE51981数据集中,BNIP3在增殖期与分泌期相对表达量分别为100.22±16.54、332.80±32.29,487.68±100.09、1425.83±157.47,8.36±0.69、9.82±0.71,均差异有统计学意义(P<0.0001);GSE25628数据集中,BNIP3在正常子宫内膜组织、EMs病人正位、EMs病人异位子宫内膜组织中的表达量分别为(10.11±0.72)、(9.19±0.56)、(8.52±0.57),三组间对比差异有统计学意义;临床样本中,正常内膜组织、EMs正位内膜组织、EMs异位内膜组织中BNIP3的mRNA表达量分别为1.15±0.57、0.56±0.19、0.36±0.08,三组间对比差异有统计学意义;BNIP3蛋白在正常子宫内膜组织、EMs正位内膜组织、EMs异位内膜组织中的表达水平分别为1.00±0.41、0.58±0.20、0.38±0.12,三组间对比均差异有统计学意义。结论BNIP3在子宫内膜组织中的表达降低与EMs的发生具有相关性。

人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析

目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78) bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区。采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子。结果通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体。荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP_1hCREG_586转录活性最高(P<0.05),pEGFP1_hCREG_358转录活性最低(P<0.05),pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_478转录活性差异均无统计学意义(P>0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5’上游序列–508/–281 bp区域。生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1。结论成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子。

E1B缺失腺病毒H101的研究进展

E1B缺失腺病毒H101是采用基因重组技术对人5型腺病毒进行基因重组得到的一种溶瘤腺病毒,它主要是删除了人5型腺病毒的E1B-55×10~3和E3区19×10~3基因片段,具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。

E1A因子在膀胱癌组织中的表达及其对基质金属蛋白酶-2的调控作用

目的 测定人膀胱移行细胞癌组织中 ,不同病理分期的人细胞 5型腺病毒早期转录单位E1A因子 (E1AF)和基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )的表达 ,探讨二者之间关系及其临床意义。 方法 采用RT PCR和WesternBlot法 ,检测 41例人膀胱癌组织中E1AF和MMP 2的mRNA及蛋白表达 ,并运用计算机图像扫描分析仪测定图像的吸光度值 (A值 )进行半定量分析。 结果 2 6例表浅性膀胱癌中 ,E1AF的阳性率为 2 6 90 % ,MMP 2和E1AF的A值分别为 36 0 9± 5 82和 2 9 0 8± 6 2 6 ;15例浸润性膀胱癌中 ,E1AF的阳性率为 6 6 6 7% ,MMP 2和E1AF的A值分别为 119 98± 10 44和 89 6 2±10 96。E1AF的阳性率、MMP 2和E1AF的A值在两组均有显著性差异 ;E1AF在G3级膀胱癌组织中的表达量显著高于G1级 ;MMP 2和E1AF的表达呈正相关 (r=0 5 36 ,P <0 0 1)。 结论 E1AF调节MMP 2的表达 ;

丙型肝炎病毒E1抗体检测及临床应用

目的 研究丙型肝炎患者血清中HCVE1抗体 ,确定HCVE1抗原在抗体检测中的应用价值。方法 应用酶联免疫吸附测定 (ELISA)方法检测 80份卫生部第 3代HCV血清参比品 ,82 1例职业献血员血清和 72 0例临床肝炎患者血清中E1抗体。结果 用E1抗原单包板检查 80份卫生部血清参比品的阳性符合率为 70 %、阴性符合率为 10 0 % ;从 82 1例职业献血员血清样品中检出E1抗体阳性率为1 9% ;从 72 0例临床肝炎患者血清中检出E1抗体阳性率为 6 8%。大部分E1抗体阳性血清 ,同时也能和HCV的Core、NS 3抗原及NS 5A抗原呈阳性反应 ,但有个别血清只对E1抗原呈阳性反应。用市购HCV抗体ELISA检测试剂盒检测为阴性的 2 18例肝炎科门诊患者、813例献血员和 84 8例一般人群血清 ,用E1抗原单包板复检 ,检出的阴性率分别为 1 4 %、1 1%和 0 9%。在 3例患者血清学转变的追踪研究中 ,HCVE1抗体都同现最早。结论 用E1工程蛋白检测E1抗体具有较高的灵敏度和特异性。E1抗体在HCV感染患者中普遍存在而且早出现 ,在临床诊断上是有意义的。