腺病毒E1B55ku癌蛋白打破hDaxx与PML在细胞核的共定位

利用间接免疫荧光试验 ,通过Confocal激光扫描生物荧光显微镜和图像软件分析腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5ku癌蛋白 (AdE1B 5 5ku)与人Daxx(humanDaxx ,hDaxx)在细胞核的定位关系 ,研究它对早幼粒细胞性白血病蛋白 (promyelocyticleukemiaprotein ,PML)与hDaxx在细胞核定位关系的影响。实验结果表明 ,AdE1B 5 5ku与hDaxx共定位细胞核 ,并打破hDaxx与PML共定位于细胞核PML致癌结构域 (PMLoncogenicdomains,PODs)

腺病毒12型E1B 55kD癌蛋白与人Daxx相互作用

目的研究腺病毒(adenovirus,Ad)12型E1B 55kD癌蛋白(ad12 E1B 55kD)与人Daxx(human Daxx,hDaxx)的相互作用及作用部位。方法利用细胞内外共免疫沉淀反应研究Ad12 E1B 55kD与bDaxx的直接结合反应,通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用。结果酵母双杂交试验结果显示Ad12 E1B 55kD通过全序列氨基酸(amino acid,aa)与hDaxx结合并发生相互作用。共免疫沉淀反应和Western blot结果证实Ad12 E1B 55KD能在细胞内外与hDaxx直接结合。结论Ad12 E1B55kD与hDaxx结合并发生相互作用。

腺病毒E1B55kD癌蛋白与hDaxx的相互作用

为了探讨腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5kD癌蛋白 (AdE1B 5 5kD)打破hDaxx和PML共定位细胞核的作用机制 ,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究AdE1B 5 5kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列。结果显示 :Ad2E1B 5 5kD通过C端 5 8个氨基酸 (aa)与hDaxx结合并发生相互作用。Ad12E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象。共免疫沉淀反应和Westernblot结果证实Ad2 / 5或Ad12E1B 5

hDaxx与12型腺病毒E1B 55KD癌蛋白在体内外的结合反应

目的 研究 12型腺病毒 (Adenovirus12 ,Ad12 ) E1B5 5 KD癌蛋白 (Ad12 E1B5 5 KD)打破 h Daxx与急性早幼粒细胞性白血病蛋白 (promyelocytic leukemia protein,PML)在细胞核共定位的机制。 方法 构建 h Daxx原核细胞表达质粒 p QE30 / h Daxx,并在大肠杆菌 (E.coli) BL2 1中诱导表达 ,用镍—氮基三乙酸 (Ni- NTA)琼脂糖加以纯化。通过体内外共免疫沉淀反应 ,Western blot方法研究 h Daxx与 Ad12 E1B5 5 KD直接结合反应。 结果 质粒 p QE30 / h Daxx在E.coli BL2 1中成功诱导表达了 h Daxx,其 N端有 6个组氨酸分子附着 (6 His- h Daxx)。Western blot结果显示 h Daxx在体内外与 Ad12 E1B5 5 KD发生直接结合反应。 结论 表达并获得纯化的 6 His- h Daxx,h Daxx能在体内外与 Ad12 E1B5 5 KD直接结合。

腺病毒2型E1B55KD癌蛋白与hDaxx相互作用

目的 :研究腺病毒 (adenovirus ,Ad) 2型E1B 5 5KD癌蛋白 (Ad2E1B 5 5KD)与人Daxx(humanDaxx ,hDaxx)的相互作用及作用部位。方法 :利用共免疫沉淀反应研究Ad2 / 5E1B 5 5KD与hDaxx的结合反应 ,通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用。结果 :酵母双杂交试验结果显示Ad2E1B 5 5KD通过C端 5 8个氨基酸 (aminoacid ,aa)与hDaxx结合并发生相互作用。共免疫沉淀反应和Westernblot结果证实Ad2 / 5E1B 5 5KD能在细胞内外与hDaxx直接结合。结论 :Ad2E1B 5 5KD与hDaxx结合并发生相互作用。

E1B55kDa缺陷型腺病毒对人肝癌细胞的杀伤研究

目的 探讨E1B5 5kDa缺陷型腺病毒dl15 2 0对肝癌细胞的体内外杀伤作用。方法 用dl15 2 0分别感染p5 3基因型不同的人肝癌细胞 ,感染后第 4天用染色的方法检测存活细胞。用RT PCR检测细胞内p5 3和p2 1Waf 1基因表达的改变 ,通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染。在SCID裸鼠瘤体内注射dl15 2 0 ,观察dl15 2 0对肝癌细胞的体内杀伤作用。结果 p5 3基因缺失的肝癌细胞Hep3B对dl15 2 0诱导的细胞毒性作用最敏感 ,超过 6 0 %的细胞被杀伤 ,而不足2 0 %的PLC/PRF/ 5 (p5 3基因突变型 )和HepG2 (p5 3基因野生型 )肝癌细胞被杀伤。腺病毒感染后 ,HepG2细胞内p5 3和p2 1Waf 1基因表达水平均明显升高。瘤体内注射dl15 2 0 ,可显著抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生长 ,而对PLC/PRF/ 5和HepG2的裸鼠移植瘤则无明显的生长抑制作用。结论 E1B5 5kDa缺失的腺病毒可以选择性地杀伤p5 3基因缺失的肝癌细胞 ,是一种潜在的肿瘤治疗手段。

DNA甲基化和缺氧对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3基因表达的影响

目的 观察DNA甲基化及缺氧与沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3（BNIP3）基因表达的影响.方法 收集食管癌细胞株KE4、Kyse-140、Caes-17和TE-7,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测BNIP3 mRNA和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测BNIP3启动子区甲基化状态.MIC-101乏氧培养系统模拟肿瘤缺氧微环境,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot检测缺氧（1％O2）、常氧及小干扰RNA（siRNA）沉默HIF-1α后Caes-17细胞中BNIP3mRNA和蛋白表达水平.结果 BNIP3在KE4和Caes-17细胞中表达水平均较高,而在TE-7和Kyse-140细胞中表达较低;同时MSP结果显示,在TE-7和Kyse-140细胞中BNIP3启动子区发生了明显的甲基化,经5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理2个细胞株后,BNIP3启动子区甲基化状态得到了逆转,同时其表达水平显著升高.缺氧条件下,Caes-17细胞中BNIP3 mRNA （4.35±0.20）和蛋白（1.23±0.04）的表达水平较常氧时（BNIP3 mRNA：1.07 ±0.12,BNIP3蛋白：0.28 ±0.03）显著升高（P＜0.05）,siRNA转染Caes-17细胞后能显著下调HIF-1α的表达（抑制率为90％）,并导致BNIP3基因的表达（BNIP3 mRNA：1.12 ±0.14,BNIP3蛋白：0.34±0.03）受到明显的抑制.结论 BNIP3基因启动子区甲基化是导致其在食管癌细胞中表达较弱的重要原因之一,甲基化酶抑制剂可逆转BNIP3的甲基化状态重新恢复其表达;缺氧能使HIF-1α蛋白的表达升高,同时上调BNIP3的表达水平.

Bcl2相互作用蛋白3在子宫内膜组织中的表达及其在子宫内膜异位症发病中的意义

目的探究Bcl2相互作用蛋白3(BCL2 Interacting Protein 3,BNIP3)表达变化与正常子宫内膜周期的关系及在子宫内膜异位症(EMs)发病中的意义。方法从GEO数据库获得GSE51981、GSE6364、GSE4888、GSE25628的基因表达谱,通过生物信息学手段比较正常子宫内膜周期组增殖期到分泌期基因表达变化,分析基因富集情况以及BNIP3在正常子宫内膜月经周期中的表达变化;比较数据集中正常子宫内膜周期组人群与内异症病人差异趋势表达基因以及各样本中BNIP3的表达,总结其在EMs发病中的意义;取23例Ⅲ⁃ⅣEMs病人正位及异位子宫内膜组织,以及25例因子宫肌瘤行子宫切除术病人的子宫内膜组织作为正常对照,通过实时荧光定量qRT⁃PCR及蛋白质印迹法(Western Blot)检测BNIP3在各组织中的表达,验证BNIP3表达变化同EMs发病的关系。结果GSE4888、GSE6364、GSE51981数据集中,BNIP3在增殖期与分泌期相对表达量分别为100.22±16.54、332.80±32.29,487.68±100.09、1425.83±157.47,8.36±0.69、9.82±0.71,均差异有统计学意义(P<0.0001);GSE25628数据集中,BNIP3在正常子宫内膜组织、EMs病人正位、EMs病人异位子宫内膜组织中的表达量分别为(10.11±0.72)、(9.19±0.56)、(8.52±0.57),三组间对比差异有统计学意义;临床样本中,正常内膜组织、EMs正位内膜组织、EMs异位内膜组织中BNIP3的mRNA表达量分别为1.15±0.57、0.56±0.19、0.36±0.08,三组间对比差异有统计学意义;BNIP3蛋白在正常子宫内膜组织、EMs正位内膜组织、EMs异位内膜组织中的表达水平分别为1.00±0.41、0.58±0.20、0.38±0.12,三组间对比均差异有统计学意义。结论BNIP3在子宫内膜组织中的表达降低与EMs的发生具有相关性。

microRNA-182-5p靶向BNIP3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的研究

目的探讨microRNA-182-5p(miR-182-5p)对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的抑制作用及其作用机制。方法将对数生长期SKOV3细胞随机分为空白组、对照组和实验组,并分别转染空白试剂、miR-182-5p拟似物、miR-182-5p+LV-BNIP3。转染后24 h,用噻唑蓝法检测细胞的增殖活性,用逆转录聚合酶链反应法检测miR-182-5p的表达水平,用Western Blotting法检测BNIP3蛋白的表达水平,用Transwell小室法检测细胞的迁移能力。结果转染后24 h,实验组、对照组和空白组的增殖活性(OD值)分别为(0.38±0.04),(0.17±0.03)和(0.39±0.02),miR-182-5p表达水平分别为(2.55±0.11),(2.52±0.13)和(0.98±0.11),BNIP3蛋白表达水平分别为(0.99±0.12),(0.42±0.11)和(0.96±0.09),穿膜细胞数分别为(138±29),(64±18)和(132±23)个,对照组的上述指标与实验组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论过表达miR-182-5p对卵巢癌SKOV3细胞具有抑制作用,BNIP3可能是miR-182-5p调节卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移的作用靶点。

缺氧诱导因子及其应答基因BNIP3和血管内皮生长因子在胃腺癌中表达及临床意义

目的检测缺氧诱导因子（HIF）及其应答基因bcl-2／腺病毒E1B19000相互作用蛋白3（BNIP3）和血管内皮生长因子（VEGF）在胃腺癌中的表达，探讨它们之间的关系以及在胃腺癌中表达的临床意义。方法采用免疫组化S-P法，检测70例胃腺癌组织和12例癌旁正常组织中HIF-1α、HIF-2α、BNIP3和VEGF的表达。结果70例胃腺癌组织中，HIF—1α、HIF-2α、BNIP3和VEGF的阳性表达率分别为61．4％、37．1％、51．4％和62．9％；而在正常对照组中的阳性表达率分别为8．3％、0、0和0，4种基因在不同组织间的表达率差异均有统计学意义（P〈0．01）。HIF—1α和VEGF的表达与胃腺癌淋巴结转移密切相关，BNIP3的表达与淋巴结转移呈负相关；HIF-1α的表达与BNIP3和VEGF的表达呈正相关。结论HIF通过调节其下游基因的表达在胃癌的发生和发展中发挥着重要作用；VEGF的表达与胃腺癌的不良生物学行为相关，而BNIP3的表达则提示预后较好。