腺相关病毒感染GDF11对2型糖尿病大鼠血管损伤的保护作用

目的探讨腺相关病毒感染上调体内生长和分化因子11(GDF11)表达水平对2型糖尿病大鼠(T2DM)主动脉损伤的影响。方法随机选取9周龄雄性SD大鼠,采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)联合诱导,建立T2DM模型。正常大鼠和糖尿病模型大鼠随机分为5组:空白对照组(Control组)、阴性病毒对照组(NC组)、GDF11腺相关病毒组(GDF11组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+GDF11腺相关病毒组(DM+GDF11组)。喂养8周后,检测大鼠血清中胰岛素(INS)、晚期糖基化终末产物(AGES)、重组生长转化因子11(GDF11)、总胆固醇(T-CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)、丙二醛(MDA)浓度;采用过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)观察糖原沉积部位,苏木精-伊红染色(HE)观察血管损伤情况,扫描电镜观察血管内皮细胞和血管弹性纤维损伤情况,蛋白印迹和免疫组化检测血管损伤相关蛋白的表达水平。结果在动物实验中与Control组相比,生化指标提示:DM组大鼠血清中AGES、T-CHO、TG、LDL-C和MDA浓度升高(P<0.05),INS、GDF11、HDL-C、ADMA显著低于Control组(P<0.05),DM+GDF11组AGES和HDL-C与DM组无明显差异,T-CHO、TG、LDL-C和MDA相比较DM组降低(P<0.05),INS、GDF11和ADMA相比较DM组升高(P<0.05)。病理染色提示:DM组PAS染色提示糖原颗粒在主动脉内皮及内皮下沉积,HE染色观察到主动脉中膜增厚,内皮细胞及弹性纤维断裂走形不规则,电镜观察到DM组血管内皮损伤,弹性纤维断裂,DM+GDF11组这些变化有所减轻。蛋白印迹和免疫组化表示内皮细胞相关蛋白在DM组中表达下降(P<0.05),间充质标志物在DM组中表达升高(P<0.05),DM+GDF11组中这些蛋白有所回调,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论提高体内GDF11表达水平可以改善糖尿病导致的主动脉血管损伤,推断可能与其抑制内皮间充质转化保护血管内皮细胞的功能从而改善血管损伤有关。

腺相关病毒在脂代谢研究和降脂基因治疗中的应用

动脉粥样硬化性心脑血管疾病是当前全球死亡率最高的疾病,而脂代谢紊乱是动脉粥样硬化性心脑血管疾病的主要病因,其既可以导致心肌梗死、脑卒中、急性胰腺炎等急性病,也可以导致慢性肾脏疾病。近年来基因治疗技术的快速发展,为脂代谢机制研究提供了有效的手段,特别是使先天性脂代谢异常患者的治愈成为可能。腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达长期稳定,是当前单基因遗传病基因治疗首选的递送工具。以AAV为载体的多种降脂基因治疗药物目前已经得到临床应用或正在进行临床试验。本文综述了AAV载体在脂质代谢机制研究的新进展及其在降脂基因治疗中的应用和前景。

表达TGF-βⅡ受体的腺相关病毒载体抑制小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖和肺转移

目的研究腺相关病毒(AAV2)介导的TGF-βⅡ受体(TβRⅡ)胞外结构域和IgG2a Fc段融合基因对小鼠4T1细胞在体内增殖和迁移的影响。方法通过分子克隆构建表达sTβRⅡ-Fc的腺相关病毒核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc,转染至HEK 293T细胞验证分泌性sTβRⅡ的表达。在HEK 293T细胞中共转染重组腺相关病毒核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc、衣壳蛋白表达质粒pAAV2和辅助质粒pHelper以制备AAV2-sTβRⅡ,碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。Western blot检测AAV2-sTβRⅡ对TGF-β信号通路下游关键蛋白Smad2/3磷酸化水平的影响,以及经治疗后各组小鼠4T1移植瘤内E-钙黏蛋白、波形蛋白、p-Smad2/3的表达水平。构建Luciferase标记的4T1细胞并荷瘤BALB/c小鼠,荷瘤小鼠随机分为处理组AAV2-sTβRⅡ、对照组AAV2-GFP和溶剂对照组PBS(6只/组),各组病毒均经尾静注射到小鼠体内。小动物活体成像观察AAV2-sTβRⅡ在小鼠体内对4T1移植瘤增殖的影响。免疫组织化学检测肿瘤组织Ki67蛋白的表达水平。免疫荧光检测小鼠肝脏内sTβRⅡ蛋白的表达水平。H&E染色观察小鼠肺部肿瘤转移灶和主要脏器的病理学改变。结果pAAV-sTβRⅡ-Fc重组质粒构建成功并在HEK 293T细胞中分泌表达sTβRⅡ。AAV2-sTβRⅡ能够感染4T1细胞并显著降低TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化(P<0.05)。AAV2-sTβRⅡ可显著抑制小鼠4T1移植瘤在体内的增殖(P<0.05)与肺转移,同时处理组肿瘤组织中E-钙黏蛋白表达水平显著上升(P<0.05)、波形蛋白表达水平显著下降(P<0.01)、Smad2/3磷酸化水平显著下降(P<0.05)、肿瘤组织Ki67蛋白显著下降。sTβRⅡ可在肝脏中表达,AAV2-sTβRⅡ未引起小鼠体质量下降和心、肝、脾、肾组织的病理学变化(P>0.05)。结论重组腺相关病毒载体AAV2介导的TβRⅡ胞外结构域编码序列,可阻断4T1细胞中的TGF-β信号通路,显著抑制小鼠体内4T1细胞增殖和肺转移。

腺相关病毒基因治疗在肝脏疾病中的应用及展望

腺相关病毒(AAV)载体基因治疗在多个临床试验中已被证明安全有效。近期,靶向肝脏的AAV载体治疗血友病的临床研究备受关注,为改善凝血功能障碍提供了有效策略。然而,外源基因导入可能导致肝损伤等不良反应,基因治疗的长期风险尚不明确。本文重点探讨AAV载体在血友病基因治疗的应用,总结其在多种肝脏疾病中的应用价值,并提出针对潜在风险的控制措施。

几种重组腺相关病毒亚型载体对小鼠睾丸细胞感染和外源基因表达的特性研究

目的评估几种重组腺相关病毒载体rAAV1、rAAV2、rAAV2/8和rAAV6对小鼠睾丸细胞的感染特性。方法使用HEK293T细胞进行rAAV包装制备病毒颗粒,经生精小管内注射或睾丸间质注射给小鼠睾丸接种病毒,术后第7天用颈椎脱臼法处死小鼠,取睾丸制作冰冻切片,通过免疫荧光染色检测和评估重组腺相关病毒载体对睾丸细胞的感染情况和外源蛋白表达情况。结果rAAV1、rAAV2、rAAV6三种亚型均可感染支持细胞和生殖细胞,rAAV2对支持细胞感染能力更强,rAAV2/8在经生精小管接种病毒时特异地感染支持细胞,在经间质接种时特异性感染间质细胞。结论rAAV1、rAAV6在睾丸细胞感染中并未表现出明显的偏好性;rAAV2在可以感染生殖细胞和支持细胞的同时表现出对支持细胞的偏好性;rAAV2/8无法穿越血睾屏障,在经生精小管接种时特异性感染支持细胞,在经间质接种时特异性感染间质细胞。

小鼠CTSK敲降重组腺相关病毒的构建及其功能研究

目的构建小鼠组织蛋白酶K(CTSK)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shCTSK),检测AAV-shCTSK在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及CTSK的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重组质粒经纯化后,利用转染试剂PEI将构建好的腺相关病毒载体、包装质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中,进行腺相关病毒包装与扩增,得到AAV-shNC以及AAV-shCTSK。利用脂肪组织原位注射将AAV病毒注射入小鼠附睾脂肪组织,2周后免疫印迹实验检测小鼠脂肪组织中CTSK蛋白的表达量及HE染色检测脂肪组织中脂滴大小。结果成功获得AAV-shNC以及AAV-shCTSK腺相关病毒。原位注射AAV-shCTSK的小鼠脂肪组织中CTSK成功敲降,脂肪组织中白色脂肪细胞显著变小。结论小鼠CTSK的敲降腺相关病毒构建成功,脂肪组织CTSK敲降引起脂肪组织中脂质含量减少。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

非人乳头状瘤病毒相关型宫颈腺癌临床病理分析(附9例)

目的:探讨非人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)相关型宫颈腺癌临床病理学特征、鉴别诊断、分子特征及治疗和预后。方法:回顾性分析9例非HPV相关型宫颈腺癌的临床特征、病理学形态、免疫表型及治疗和预后,并复习相关文献。结果:患者均为女性,年龄18~57岁,平均45岁。4例宫颈透明细胞癌,5例宫颈胃型腺癌。3例宫颈透明细胞癌临床表现为异常子宫出血,1例年轻患者表现为宫颈赘生物。病理组织学特征表现为小管状、微囊型、乳头状或呈实性生长方式,肿瘤细胞内含透亮、富于糖原的细胞质,细胞核大,核仁明显,呈靴钉样外观,可见致密的嗜酸性间质和玻璃样变小体。免疫组化HNF1-β、Napsin-A、PAX8阳性,Ki-67增殖指数较高(60%~80%),ER、PR、p16阴性;3例宫颈胃型腺癌表现为阴道排液,1例因盆腔包块入院检查发现,1例体检发现。影像学对宫颈胃型腺癌具有特征性,2例胃型腺癌磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)示宫颈囊实性肿块。病理组织学特征表现为肿瘤性黏液腺体不规则浸润性生长,超出正常宫颈内膜腺体的位置,腺体形态不规则、大小不一,经常成角或囊状,有一些伴有腔内乳头,往往腺体紧邻厚壁血管,间质反应一般轻微或无。肿瘤细胞边界较为清晰,胞浆透明至嗜酸性,内含丰富的黏液,细胞核可有异型性,核分裂象较为罕见。宫颈胃型腺癌表达MUC6、CEA,60%病例p53表现为突变型,p16阴性,宫颈胃型腺癌阿利辛蓝-过碘酸雪夫染色(Alcian blue Periodic acid-Schiff,AB-PAS)呈PAS阳性。所有9例患者HPV检测均为阴性。结论:宫颈透明细胞癌和胃型腺癌均为非HPV相关型宫颈腺癌,临床少见,恶性度高,具有一定的组织形态及免疫组化特征,联合运用一组免疫组化标记物有助于该类疾病的诊断。

腺相关病毒载体基因治疗药物生物分析技术及药代/药效动力学研究进展

腺相关病毒(AAV)载体是近年来基因治疗领域的研究热点,由于其致病能力弱、免疫原性低、组织特异性强等特点,在基因治疗领域展现出了极大的潜力。AAV载体本质上为具有感染活性的病毒,其安全性和有效性需要新的生物分析技术来评估。目前,相关行业指南明确了对AAV载体生物分布、脱落、免疫原性等内容的评估需求,但对生物分析相关的要求却十分有限。本文从生物分布、脱落、免疫原性和药代动力学/药效动力学(PK/PD)研究4个方面对AAV载体基因治疗药物生物分析技术及PK/PD研究面临的挑战进行总结,以期为AAV载体基因治疗产品的临床研发提供参考。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

生物质谱技术在腺相关病毒(AAV)载体制剂质量控制中的应用

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种基因治疗中常用的病毒载体。由于其安全性较高且能够靶向多种细胞,在临床前和临床研究中得到了较多的应用。不过在设计和生产的过程中,AAV载体有着诸多会影响其安全性和疗效的关键质量属性。生物质谱技术的发展和应用为生物大分子的研究提供了一个便捷的平台,尤其是在蛋白质序列、结构和相互作用方面。对于AAV载体而言,质谱技术可以实现衣壳蛋白比率、翻译后修饰、血清型、空衣壳比率的测定或表征,从而协助对AAV载体的质量控制。与现有方法相比,质谱技术具有样品需求量少、分析快速灵敏、适用于完整AAV载体的分析和质量分辨率高的优点,并且可以区分空衣壳、满衣壳和部分包封的衣壳。未来,通过将更加高效的蛋白质分离技术与质谱技术联用、开发新的信息处理软件平台和新的质谱检测方法,质谱技术有望在AAV载体的设计和生产中发挥更加重要的作用。

腺相关病毒介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病中应用的现状与展望

儿童神经遗传罕见病多起病早,缺乏特异性治疗手段,病死率高,严重危及患儿的健康及生命。以腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的基因治疗为代表的疾病修正治疗为儿童神经遗传罕见病的治疗提供了新的方向。目前,AAV介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病治疗中有了突破性的进展,已有针对脊髓性肌萎缩症、芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症、杜氏肌营养不良症的基因治疗药物获得美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)/欧洲药品管理局(European Medicines Association,EMA)批准上市。多项临床前以及临床试验研究数据显示AAV介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病中有良好的应用前景,针对罕见病药物启动快速审批流程,这为神经遗传罕见病患儿的治疗带来了希望。但AAV介导的基因治疗属于新兴技术,存在着一定的风险和挑战,需要建立规范的监管体系以及健全的长期随访制度,以评估基因治疗的有效性及安全性。

抗阿尔茨海默病重组腺相关病毒的制备与活性研究

目的:制备可表达抗阿尔茨海默病单链抗体AT8-scFv的重组腺相关病毒AAV8-AT8-scFv,并探究其体内外活性。方法:利用293T细胞对重组病毒进行包装与纯化;SDS-PAGE、RT-qPCR对重组病毒的理化性质进行表征;细胞感染、Western blot法检测重组病毒的体外感染活性;以BALB/c小鼠为动物模型进行免疫,ELISA法、活体成像检测重组病毒的体内表达情况。结果:成功制备重组腺相关病毒AAV8-AT8-scFv,该病毒具有较好的感染能力,并可在小鼠体内长期稳定表达。结论:成功获得具有良好生物学活性的重组腺相关病毒,为阿尔茨海默病的免疫治疗提供新思路。

腺相关病毒(AAV)载体研究进展

基因治疗的载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用,其中腺相关病毒(AAV)载体具有低致病性、对宿主免疫原性弱、长期稳定表达、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点,是目前发展最热,也是最有希望的载体之一,已被广泛应用于临床研究。本文综述了腺相关病毒载体的研究进展,包括AAV的血清型、新型载体的开发、生产工艺及其放大及临床研究及讨论了AAV载体还存在的问题及可能的解决方案。随着腺相关病毒载体研究的进展,新的载体系统必将在基因治疗中发挥更重要的作用。

腺相关病毒过表达IL22可有效改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎

目的探讨白介素22(IL22)在小鼠葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的急性结肠炎中的作用及其机制。方法选取8周龄雄性同窝IL22敲除小鼠(IL22-/-)及对照基因型小鼠(IL22+/+)各3只,给予2组小鼠2.5%DSS自由饮水6 d、正常饮水2 d构建小鼠急性结肠炎模型,记录小鼠体质量变化及疾病活动指数(disease activity index,DAI),干预8 d后行小鼠肠道内窥镜检查,测量2组小鼠结肠长度以及主要免疫器官脏器指数,采用Western blot检测白介素1α(IL1α)、白介素1β(IL1β)、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等促炎细胞因子蛋白水平表达;选取8周龄雄性C57BL/6小鼠建立腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)转染模型,给予DSS诱导结肠炎模型,设置PBS组(n=5)、AAV-mock+DSS组(n=5)、AAV-IL22+DSS组(n=5),采用免疫荧光检测各组结肠闭合小环蛋白1(ZO-1)、钙粘附蛋白(E-claudin)表达,采用Western blot检测IL22、闭合蛋白(Occludin)、信号传导及转录激活蛋白3(Stat3)、p-Stat3蛋白表达水平。结果与IL22+/+组比较,IL22-/-组小鼠在DSS诱导后第8天体质量显著降低(P<0.05),DAI评分(P<0.01)和肠镜评分显著升高(P<0.05),组织损伤加重,病理评分显著升高(P<0.01),促炎细胞因子IL1α、IL1β、cleaved-IL1β、IL6、TNFα表达上调(P<0.05)。与AAV-mock+DSS组相比,AAV-IL22+DSS组可逆转DSS诱导结肠炎,结肠组织炎症水平显著降低(P<0.05),免疫荧光结果示E-claudin表达显著升高(P<0.05),Western blot结果显示Occludin、p-Stat3表达水平显著增高(P<0.01)。结论IL22缺乏加重小鼠DSS诱导结肠炎,而通过AAV过表达IL22能增强结肠紧密连接蛋白表达,减少炎症浸润,缓解DSS肠炎,其机制可能与Jak/Stat3通路激活有关。

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT-PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFα细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示:所构建的重组病毒rAAV2/hTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR:Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。