腺相关病毒(AAV)载体研究进展

基因治疗的载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用,其中腺相关病毒(AAV)载体具有低致病性、对宿主免疫原性弱、长期稳定表达、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点,是目前发展最热,也是最有希望的载体之一,已被广泛应用于临床研究。本文综述了腺相关病毒载体的研究进展,包括AAV的血清型、新型载体的开发、生产工艺及其放大及临床研究及讨论了AAV载体还存在的问题及可能的解决方案。随着腺相关病毒载体研究的进展,新的载体系统必将在基因治疗中发挥更重要的作用。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(六)

五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备,应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性,拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂,提供基本的生产工艺信息,包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性,如质粒瞬转工艺中质粒的用量和配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

腺相关病毒载体(AAV)在视网膜色素变性基因治疗中的应用

随着分子生物学的发展 ,应用基因转移技术治疗视网膜色素变性疾病成为可能。目前研究认为腺相关病毒载体 (AAV)能使外源基因有效地导入感光细胞而且在细胞中稳定长期表达 ,而且对细胞无毒性 ,将有可能成为最有效的基因转染工具。本文对AAV病毒的形态、生长和分子生物学特征、AAV介导的视网膜细胞基因转移、AAV病毒载体在视网膜色素变性基因治疗中的应用。

过表达HGF基因AAV9型腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因重组腺相关病毒过表达质粒载体,制备并纯化HGF过表达的高滴度重组腺相关病毒。方法合成HGF基因并利用PCR扩增,退火形成双链,与pAAV-ITR-CMV质粒经XhoⅠ单酶切连接构建质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF,转化至大肠杆菌DH5α,提质粒后经酶切和测序鉴定证实重组质粒克隆正确,将重组质粒转染至293FT细胞中包装为腺相关病毒。小鼠注射病毒后通过Western blot法评价HGF的蛋白表达水平。结果扩增产物包含HGF CDS全序列的2186 bp,酶切结果与测序结果说明PCR扩增HGF目的片段成功;实时荧光定量PCR检测结果显示,纯化后所得的过表达HGF的腺相关病毒滴度为5.22×10^(12) vg·mL^(-1);HGF过表达组HGF蛋白相对表达含量较生理盐水组与阴性对照组均升高(P均<0.01)。结论本研究成功构建了HGF腺相关病毒载体且病毒滴度达到普通动物注射要求,证明腺相关病毒载体构建成功。

重组腺相关病毒:很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.

hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES),构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体(adeno-associated virus,AAV),并对其进行鉴定。方法以AAV腺相关病毒包装系统(helper-free system)为基础,将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中,形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因,先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点,获得重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,同时包装含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的重组病毒rAAV-IRES-GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率,收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后,病毒包装效率达95%～100%,收获的重组病毒具有较高浓度及活性,感染AAV-HT1080效率达90%,荧光计数法测定病毒感染滴度达5.5×1011vp/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF165及hBMP-7片段,重组病毒包装成功。结论成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF165及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。

Smad6和Smad7基因腺相关病毒载体的构建及其表达

目的 :构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒 (AAV)载体 ,并转染到人肾小管上皮细胞中表达。方法 :利用基因重组技术 ,采用BamHI和XhoI双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad6 /flag和Smad 7/flag融合基因片断切出 ,再克隆到质粒pAAV MCS中 ,构建重组质粒pAA Smad 6 /flag和pAA Smad 7/flag。采用磷酸钙沉淀法 ,以重组质粒或pAAV LacZ以及pAAV RC、pHelper共转染HEK2 93细胞 ,产生均有传染性的病毒颗粒。再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中 ,用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达。结果 :成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体 ,并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7。结论 :肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7,为今后建立Smad 6和Smad

腺相关病毒载体介导的人内皮抑素的体外表达及对内皮细胞抑制作用的研究

抗血管生成基因治疗是一有希望的抑制肿瘤生长及转移的方法。在实验中构建了含有人内皮抑素 (endo statin)基因的重组腺相关病毒载体rAAV -hE。所包装纯化的重组病毒滴度达 0 5× 10 12 v g /ml。rAAV -hE能有效感染培养细胞 ,EIA法检测培养液上清中内皮抑素浓度达 36 4 2ng/ml。rAAV介导所表达的内皮抑素对人脐静脉内皮细胞 (ECV - 30 4 )和牛毛细血管内皮细胞 (BCE)具有抗增殖抑制作用 ,抑制率分别为 6 8 1%和 4 1 6 %。此结果为进一步的动物实验奠定了基础 。

腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较

目的比较腺相关病毒(AAV)载体和慢病毒(LV)载体在间充质干细胞(MSCs)基因转染中的效率。方法密度梯度离心法分离培养MSCs,HE染色、Nestin免疫荧光染色鉴定,Brd U标记观察增殖情况。分别包装AAV与LV假病毒颗粒,并感染MSCs,通过β-gal染色和绿色荧光蛋白检测,分别计算两者的转染效率。结果 MSCs成功从骨髓分离。AAV载体介导的基因转染率为49.1%,LV载体的转染率为91.4%(P<0.01)。结论 LV载体介导的基因转染方法转染效率更高。

一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建

目的:构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体。方法:利用RT-PCR方法,从Balb/C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA,经测序证实后插入Pzac2.1质粒,用磷酸钙沉淀法,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成,设立eGFP基因为对照。结果:1592bp的小鼠T-bet基因被成功克隆,分析表明,与Genbank中发表的序列相比具有99.8%的同源性。重组质粒Pzac2.1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后,经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装。结论:成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet,为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础。

腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的非致病特性使得以其为基础的重组病毒载体具有卓越的安全性,成为在基因治疗中最富吸引力的候选载体之一,并且在多种疾病的临床治疗中广泛应用。在过去的十余年中,随着分子病毒学领域对AAV基础研究的进展,研究者不断地为重组腺相关病毒的生产和改良提供新的思路和方案,以改善其对宿主或靶向细胞的感染选择性和转导效率,其中相当部分已逐渐向临床试验阶段过渡。本综述将在介绍AAV基本生物学特征的同时,结合一些实验室研究的成功案例,重点讨论AAV的改良策略、实施方案与应用特点,并对当前以AAV为载体的基因治疗的全球现状及其所面临的挑战与前景进行分析和探讨。

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。

不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展

重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)具有弱免疫源性、可介导治疗基因长期稳定表达等优势,使其被公认为基因治疗的理想载体之一。目前临床研究广泛采用的AAV-2血清型载体对部分靶器官和组织的转导效率不十分理想,同时AAV-2中和抗体会干扰此型载体介导的基因转移效率。为了克服上述不足,众多学者将开展了针对其他7种天然血清型AAV(AAV-1,AAV-3至AAV-8)的研究。研究表明这些新型载体的组织亲嗜性和针对同一靶器官的转导效率与AAV-2不同,并且规避了AAV-2免疫应答对载体介导基因转移效率的影响。在视网膜中AAV-1、AAV-5的表达检出较早,表达水平高于AAV-2;AAV-5在胰腺的表达水平也明显高于AAV-2;AAV-4,AAV-5在中枢神经系统的转导效率和表达水平均显著高于AAV-2,并且表达不仅局限于注射部位;AAV-1,3,4,5,7型载体在肌肉的表达水平均超过AAV-2,其中又以AAV-1最为显著;肺组织中AAV-1,5,6型的表达较高,其中AAV-5表达量又高于AAV-1和AAV-6;而肝脏表达水平由高到低的先后顺序为AAV-1>AAV-5>AAV-3>AAV-2。这些研究均提示了新型AAV载体在基因治疗研究和应用领域的巨大潜力。

重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体的构建

目的构建重组人骨形态发生蛋白7(hBMP7)的腺相关病毒(AAV)载体。方法通过RT-PCR方法,从HEK293细胞中扩增hBMP7全长cDNA并亚克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV。将pSNAV-hBMP7质粒DNA转染BHK-21细胞,筛选出携带hBMP7的AAV载体细胞株—BHK-21细胞。用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2按MOI=0·1感染BHK-21载体细胞株后收获病毒液,通过氯仿—PEG/NaCl沉淀—氯仿抽提纯化病毒。结果所克隆的hBMP7全长cDNA经测序证实和已知hBMP7序列完全一致。通过用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染携带hBMP7基因的AAV载体细胞株BHK-21细胞的方法获得了滴度为2×1012vg/ml、纯度达99%的重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体(AAV-hBMP7)。结论RT-PCR方法从HEK293细胞中扩增克隆hBMP全长cDNA是一种有效可行的方法。成功地构建了高滴度、高纯度的AAV-hBMP7载体,为进一步体内及体外研究基因治疗促进骨愈合提供了有力的工具。

NOS反义RNA重组腺相关病毒载体体内提高脑细胞耐缺血能力的实验研究

目的探讨二种分别携带神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV—AsnNOS和rAAV-AsiNOS）提高脑细胞耐受缺血能力的作用机制。方法应用立体定位技术将预处理好的病毒载体转染至将要梗死侧的基底节区，转染病毒滴度为2×10^9mL～，并将SD大鼠分为4组：即rAAV-AsnNOS组，rAAV-AsiNOS组，rAAV—LacZ组和对照组；处理后运用MACO建立缺血模型，每组分为缺血早期和缺血晚期，流式细胞术（FCM）检测NT阳性细胞百分比和细胞凋亡率，逆转录反应系统（RT-PCR）分析nNOS、iNOS，p38MAPK，Caspase-3 mRNA的表达。结果一定剂量的重组病毒载体转染到大鼠海马区域，无神经损伤症状；转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血早期（缺血1～6h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV—AsiNOS组降低；转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血晚期（缺血24—72h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV-AsnNOS组降低，差异有统计学意义。结论转染重组病毒载体后动物模型脑神经细胞能够耐受缺血损伤，转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血早期抑制nNOS、p38MAPK和Caspase-3的表达，转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血晚期抑制iNOS、038MAPK和Caspase-3的表达，从而在缺血后抑制神经细胞凋亡的发生。