鸡腺苷琥珀酸裂解酶互作蛋白的筛选及其功能分析

通过探究鸡腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase)基因ADSL与其互作基因的调控关系,为进一步研究ADSL在肌肉中高表达的原因和ADSL影响肌肉风味的机制提供参考。本研究构建了鸡(gallus)ADSL基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-ADSL,将pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1质粒分别转染鸡成肌细胞,提取表达成功的细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)联合质谱分析鉴定与鸡ADSL蛋白互作的细胞蛋白,并对结果进行GO功能注释、KEGG通路和蛋白互作网络分析。通过分析筛选出RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10蛋白,检测在ADSL基因过表达和沉默状态下,RPL 4、PDLIM 5、ACTG 1和SRSF 10基因在成肌细胞中的表达情况。结果表明,与ADSL互作的蛋白共94个;生物信息学分析表明,这些蛋白定位于细胞结构体、胞内和含蛋白质的复合物上,它们主要参与细胞进程、生物调节和刺激反应等生物进程。间接免疫荧光结果显示,重组蛋白pEGFP-C1-ADSL主要定位于细胞核和细胞质。ADSL过表达时,成肌细胞内RPL 4基因和PDLIM 5基因的表达下调,ACTG 1和SRSF 10基因的表达上调;当ADSL被沉默后,成肌细胞内RPL 4和ACTG 1基因的表达上调。研究结果丰富了调控风味的ADSL蛋白,为进一步了解ADSL的功能及该基因在肌肉中高表达提供了参考。

家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系

根据腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子2的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、白耳鸡、藏鸡以及红色原鸡两个亚种进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现3484位碱基处发生C→T突变。对3种基因型的肌肉肌苷酸含量的最小二乘分析结果显示TT型(突变型)个体的肌肉肌苷酸含量极显著地高于CT型、显著地高于CC型个体,CT型个体也稍高于CC型,但差异不显著,初步推测该位点可能与肌肉肌苷酸含量有关。根据该多态位点的基因频率,基于Nei氏的遗传距离运用NJ聚类法构建系统发生树,进行家鸡与原鸡的亲缘关系分析,结果发现,丝羽乌骨鸡与白耳鸡的亲缘关系最近,藏鸡和中国红原鸡亚种的亲缘关系也较近,中国地方家鸡品种与中国红原鸡亚种的亲缘关系较近,而与泰国红色原鸡的亲缘关系较远,隐性白羽鸡与原鸡亲缘关系最远,初步得出中国家鸡有自己独自的血缘来源的结论。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶(Adsl)基因多态性及其与肌苷酸含量相关研究

腺苷琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一,催化嘌呤核苷酸合成过程中的两个重要反应:(1)由SAC IAR生成AICAR的反应;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆,并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249G→A(TH),717 C→G(TH),985 A→G(TH)仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW),1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH),1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→A la(305),A la→Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。

5个鸡种腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因外显子9 SNP及其与鸡肉肌苷酸含量的相关分析

根据腺苷琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子9的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现9 839位碱基发生了突变,由C突变为A,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,发现突变后引起ADSL基因第273位氨基酸由Pro突变为Thr,为错义突变。经独立性检验,发现基因型频率和基因频率分布与品种有关,但进一步方差分析并没有显示出该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间存在关联。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因适用性进化分析

采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以肝脏总RNA为模板,对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)编码区序列进行克隆和测序;并结合Gen-Bank中已提交的家鸡、鱼类、哺乳动物和人类等ADSL基因序列,采用基于最大似然法的密码子置换模型分析ADSL基因编码区序列在进化过程中承受的选择压力。结果RT-PCR方法准确获得了泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡ADSL基因编码区序列,全长为1 380bp。"分支特异模型"检验结果表明,ADSL基因在不同物种进化过程中较为保守,未受到正选择作用。鸡ADSL基因序列的"位点特异模型"检验未发现正选择位点。研究结果有助于了解鸡ADSL基因的结构及进化历程。

腺苷琥珀酸裂解酶缺乏症3例报告并文献复习

目的总结3例腺苷琥珀酸裂解酶缺乏症患儿的临床及遗传学特征,并进行文献复习。方法回顾性分析2018年1-12月就诊于北京大学第一医院儿科的3例腺苷琥珀酸裂解酶缺乏症患儿临床、脑电图和影像特点及基因检测结果。结果 3例患儿癫痫起病年龄分别为生后45 d、10个月和38 d。癫痫发作表现为局灶性发作3例,肌阵挛发作1例,全面强直阵挛发作1例,不典型失神1例,痉挛发作1例,游走性局灶发作1例。2例多入睡或刚醒时发作,有丛集性,感染发热、声音刺激易诱发发作,1例感染期间发作呈癫痫持续状态。1例头颅磁共振成像异常,包括脑萎缩,海马体积减少,脑沟增宽,脑室扩大。3例发育落后并有孤独症谱系障碍表现,2例不自主运动、肌张力低。3例患儿中,表型符合LGS综合征1例,婴儿癫痫伴游走性局灶发作1例。3例腺苷琥珀酸裂解酶基因均为复合杂合突变。结论腺苷琥珀酸裂解酶缺乏症基因突变相关癫痫的临床特点为起病年龄早,局灶性发作多见,多入睡或刚醒时发作,有丛集性,感染发热、声音刺激易诱发发作,多伴发育落后、不自主运动、肌张力低下、孤独症谱系障碍,影像学可正常或大脑皮质萎缩、侧脑室增大。

大黄鱼adsl基因的克隆及其表达量与肌苷酸含量的关联性分析

大黄鱼(Larimichthys crocea)风味品质劣化严重制约其产业的健康发展。为探究大黄鱼腺苷琥珀酸裂解酶(Adeny-losuccinate lyase,ADSL)在风味关键物质肌苷酸(Inosine monophosphate,IMP)合成中的作用,克隆了大黄鱼adsl基因的开放阅读框(ORF)序列,分析了其基因结构和进化特征;在明确其组织分布特性的基础上,比较了不同养殖规格大黄鱼肌肉组织中的IMP含量和adsl基因的表达差异。结果显示:大黄鱼adsl基因ORF全长1446 bp,编码481个氨基酸。对应的蛋白质相对分子质量为54.6 kD,等电点为6.19,包含N末端的裂解酶1和C末端的ADSL_C两个结构域。大黄鱼与棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)的亲缘关系最近,相似性达98.54%。大黄鱼adsl基因由12个外显子和11个内含子组成,其mRNA在肌肉组织中表达量最大,且显著高于其他组织(P<0.05)。随着体质量的增加,养殖大黄鱼肌肉组织中的IMP含量显著增加(P<0.01);adsl基因mRNA的相对表达量也呈类似规律。相关性分析显示,大黄鱼肌肉组织中adsl基因的相对表达量与对应的IMP含量呈显著正相关(r=0.962,P<0.0001)。研究结果为进一步探明adsl基因在大黄鱼IMP合成及风味形成中的作用机制提供了参考资料。

鸡ADSL基因和GARS-AIRS-GART基因对鸡肉肌苷酸(IMP)含量的影响

以鸡ADSL基因、GARS-AIRS-GART基因为侯选基因,以隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡为试验材料,采用PCR-SSCP方法对ADSL外显子2、GARS-AIRS-GART基因5′侧翼序列进行SNPs检测。结果各发现了一个单核苷酸多态性位点。各种基因型与胸肌IMP含量的最小二乘分析结果表明:ADSL基因TT型个体的胸肌肌苷酸含量极显著地高于CC型、显著地高于CT型个体,CT型个体也高于CC型,但差异不显著;GARS-AIRS-GART基因TT型个体的胸肌肌苷酸含量极显著地高于CT型和CC型个体,CT型个体也高于CC型,但差异不显著。ADSL和GARS-AIRS-GART基因的合并基因型对IMP含量也有显著的影响,合并基因型为TTTT的个体IMP含量显著高于CCCC合并基因型的个体,高出1.584 mg/g,因此可以利用该合并基因型对鸡的肉质风味性状进行标记辅助选择。

沙棘叶黄酮对热应激条件下肉鸡肌苷酸及基因表达的影响

试验选用健康1日龄AA肉鸡公雏600只,采用单因素完全随机分组试验设计,从中随机抽取240只,分4组,每组4个重复,每个重复15只,4组分别为基础日粮组(对照组)、试验组Ⅰ(基础日粮+0.025%沙棘叶黄酮)、试验组Ⅱ(基础日粮+0.05%沙棘叶黄酮)、试验组Ⅲ(基础日粮+0.1%沙棘叶黄酮)。第4周时进行热应激,温度为(36±2)℃,持续1周,然后温度恢复正常。在第3、4周末屠宰采样,利用高效液相色谱法(HPLC)检测不同组间的肌苷酸(IMP)含量,利用Real-time PCR方法检测不同组间的腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因表达。第4周试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胸肌IMP含量分别比对照组极显著提高了33.94%、75.76%和49.09%(P<0.01);第4周试验组Ⅰ、Ⅲ肝脏ADSL mRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01)。试验表明,基础日粮中添加沙棘叶黄酮后,可提高胸肌IMP含量及其相关基因ADSL mRNA的表达量,从而缓解热应激导致的肉质风味的下降。

不同日龄略阳乌鸡肌肉中肌苷酸含量的变化规律

以18日胚龄及6、180日龄黄羽鸡和略阳乌鸡为研究对象,探讨不同发育时期肌肉中风味物质的形成规律。采用高效液相色谱仪测定腿肌和胸肌中的肌苷酸含量,利用荧光定量PCR方法检测肌苷酸合成关键酶腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因的mRNA表达情况。结果显示:黄羽鸡和略阳乌鸡腿肌中ADSL基因的表达、肌苷酸的含量均在6日龄时最高,胸肌中肌苷酸在180日龄时含量最高,表达趋势基本一致;略阳乌鸡腿肌和胸肌的肌苷酸含量在180日龄时明显高于黄羽鸡。同时,ADSL基因的表达量在不同时期均明显高于黄羽鸡,表明成年略阳乌鸡的肉品质优于黄羽鸡。

中草药添加剂对绵羊肉中鲜味物质质量分数及ADSL基因表达的影响

旨在研究自拟中草药添加剂对绵羊肉中鲜味物质质量分数和腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)表达的影响。32只绵羊随机分为4组,空白组仅饲喂基础日粮,试验组按照日粮质量分数1%的剂量分别添加中草药方剂Ⅰ、方剂Ⅱ和方剂Ⅲ,饲喂60d后,采用高效液相色谱(HPLC)法检测肉样中肌苷酸(IMP)及其相关代谢物的质量分数,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测ADSL基因相对表达水平,分析ADSL基因表达与IMP质量分数的相关性。结果表明,所有试验样品中均不含三磷酸腺苷(ATP)成分,二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)的质量分数亦很低,各组间差异不显著(P>0.05);3个中草药方剂均能不同程度地提高绵羊肉中IMP及其分解产物的质量分数,其中方剂Ⅲ组的IMP、肌苷(INO)和校正肌苷酸(IMPc)值极显著地高于对照组(P<0.01),与方剂Ⅰ、Ⅱ组相比差异显著(P<0.05);方剂Ⅲ组羊肉样中ADSL基因相对表达水平与空白组相比存在显著性差异,且ADSL基因表达与IMP、IMPc呈显著正相关(P<0.05)。说明,中草药方剂Ⅲ可显著改善绵羊肉风味,ADSL基因可作为肉质风味的候选基因。

鸡肉质鲜味特性相关基因的克隆及序列分析

本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆, 并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249 G→A(TH)、717 C→G(TH)、985 A→G(TH) 仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW)、1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH)、1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→Ala(305)、Ala-Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。另外对几种脊椎动物Adsl基因核苷酸序列水平、蛋白质水平同源性进行了比较分析。

文昌鸡肉质相关基因多态性分析

为了探究与肉质风味相关基因A-FABP和ADSL基因在文昌鸡群体中的遗传变异情况,本研究运用连接酶检测反应的方法(PCR-LDR)对文昌鸡A-FABP基因C51T变异位点和ADSL基因C3484T变异位点进行基因分型,并分析了这两个位点在文昌鸡群体中的基因型、基因频率和哈-温平衡情况。结果显示,A-FABP基因C51T和ADSL基因C3484T位点均检测到CC、TT和CT3种基因型,A-FABP基因C51T基因型频率(CC、TT和CT)和等位基因频率(C、T)分别为0.11、0.37、0.52和0.37、0.63;ADSL基因C3484T基因型频率(CC、TT和CT)和等位基因频率(C、T)分别为0.40、0.45、0.15和0.63、0.37;文昌鸡在这两个变异位点均处于哈-温平衡状态(P>0.05)。