油田硫酸盐还原菌APS-MPN-PCR快速定量检测方法

为了解决现有油田污水中硫酸盐还原菌检测周期长、检测费用较高的问题，应用聚合酶链式反应（PCR）技术与倍比稀释法（MPN）相结合的APS-MPN-PCR法，对硫酸盐还原菌进行快速定量检测．从污水中制备了直接用于PCR扩增的菌液，保证了定量检测的准确性；建立以腺苷酰硫酸还原酶基因（APS）为靶位点的通用探针APS7F和APS8R的反应体系和扩增条件．研究结果表明，与液体稀释培养法相比，该方法检测灵敏度提高了两个数量级，操作时间缩短（整个检测过程只需要3～4h），检测费用也降低．该方法检测结果非常稳定，真实的表征了污水中实际的SRB菌数量，可以在生产中应用．

硫酸盐还原菌去除铅的实验研究

考查了初始p H值、反应温度、接种量等对硫酸盐还原菌菌株的生长和对重金属铅去除效果的影响,应用X射线衍射(XRD)、表面能量色谱分析(EDS)对沉淀物进行了表征。结果表明,该菌株生长及去除铅的最佳条件为:p H=8.0,温度30℃,接种量10%,该条件下的去除率高达99.79%。所得到的沉淀物为硫化铅,立方方铅矿结构,结晶度良好。进一步研究了最佳条件下不同初始浓度硝酸铅对硫酸盐还原菌细胞中亚硫酸盐还原酶(SiR)和腺苷酰硫酸还原酶(APS)比活力的影响。结果表明,硝酸铅质量浓度低于950mg/L时,亚硫酸盐还原酶和APS还原酶比活力受到轻微抑制,当硝酸铅质量浓度为1 100 mg/L时,其比活力受到明显的抑制。重金属铅对亚硫酸盐还原酶比活力抑制作用相对明显。

ABCA1基因R219K多态性对AMI患者他汀药物调脂效应的影响

目的:研究三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)R219K基因多态性和AMI患者血脂水平关系以及他汀药物调脂疗效与患者不同基因型的关系。方法:AMI患者(150例),其中ST段抬高型心肌梗死120例,非ST段抬高性心肌梗死30例,对照组(100例)为门诊健康体检者,均清晨空腹采血,测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)。并采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFIP)方法对R219K基因多态性进行检测,AMI患者给与普伐他汀40 mg/d,12周后重复测定上述血脂水平。结果:ABCA1基因的R219K多态性基因型频率和等位基因频率在对照组和AMI组相似(P>0.05);AMI患者中RR基因型较KK基因型具有明显升高的血清TG水平和较低的HDL-C水平(P<0.05);KK基因型患者较RR基因型患者相比,普伐他汀治疗明显增加HDL-C水平(P<0.05)。结论:ABCA1基因的R219K多态性与血脂水平相关,并且可影响AMI患者HDL-C水平对普伐他汀的治疗效果。

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的检测真核表达克隆pcDNA3．1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（NMNAT1）的水平和有效性。方法采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段，构建到T载体中，并转接到pcDNA3．1中；同时设计引物进行全基因测序；采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因，通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3．1-NMNAT1的表达水平和表达有效性，并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法。结果成功钓取了小鼠源NMNAT1基因，测序结果显示与数据库序列完全匹配，pcDNA3．1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系，48h以后收取细胞，经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测，结果显示表达克隆pCDNA3．1-NMNAT1能同时在tuRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因。结论成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA，与Pubmed序列完全一致，并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质。

耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验指导肺鳞状细胞癌二线化疗的临床研究

目的：探讨耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验（ATP-TCA）对肺鳞状细胞癌二线化疗的指导意义，为临床治疗提供参考。方法收集组织病理学或细胞学确诊的、行NP方案一线化疗出现病情进展的肺鳞状细胞癌患者150例，采用实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR）行耐药基因切除修复交叉互补基因1（ERCC1）mRNA、核苷酸还原酶M1亚基（RRM1）mRNA检测及ATP-TCA。两种方法检测结果同时显示对吉西他滨＋顺铂（GP）化疗方案敏感者，行二线GP方案全身化疗（GP组）；两种方法检测结果同时显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线多西他赛＋顺铂（DP）化疗方案（DP组），两组均行2～4个周期全身化疗。随访胸部CT，观察化疗有效率、中位无进展生存（PFS）及中位生存期。结果GP组有效率为36.2%（17／47），DP组为28.1%（26／92），两组差异有统计学意义（χ2＝4.274，P＜0.05）；GP组与DP组中位PFS时间分别为4.2个月（95%CI 3.485～5.348个月）和3.6个月（95%CI 2.685～4.648个月），差异有统计学意义（P＜0.05）；GP组与DP组中位生存期分别为9.6个月（95%CI 8.283～10.637个月）和8.9个月（95%CI 7.384～9.648个月），差异无统计学意义（P＞0.05）。结论耐药基因检测联合ATP-TCA对于晚期肺鳞状细癌二线化疗方案的选择有一定的指导意义。

高脂饲料诱导的肥胖大鼠肠道内硫酸盐还原菌的定量检测

目的检测高脂饲料诱导大鼠肥胖过程中,大鼠肠道内硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)的数量变化,为研究SRB与肥胖的关系提供参考。方法 20只Wistar大鼠随机分为2组(每组10只),一组饲喂高脂饲料(HFD组)18周,另一组饲喂正常饲料(NCD组,即对照组)18周。以编码腺苷酰硫酸还原酶α亚基的基因(aprA)作为分子标记,通过荧光定量PCR的方法检测两组大鼠在0、8和18周,肠道内SRB的数量变化;同时,以16S rRNA基因作为标记基因定量大鼠肠道内总菌的数量,以计算肠道内SRB在总菌中的比例变化。结果分组饲喂8周后,高脂饲料饲喂组大鼠的体重与正常饲料组相比显著升高。对SRB的定量结果显示,饲喂8周和18周,高脂饲料组大鼠肠道内SRB的数量和含量与正常饲料组相比显著升高。结论大鼠肠道中的硫酸盐还原菌与饮食诱导的肥胖密切相关,为进一步研究SRB在肥胖及其相关代谢疾病的发生发展中的作用提供了依据。

重度肥胖症患者膳食干预前后肠道内硫酸盐还原菌的定量检测

目的检测重度肥胖症患者膳食干预过程中,肠道内硫酸盐还原菌(SRB)的数量变化,为进一步研究SRB与肥胖的关系提供参考。方法以SRB基因组中的重要功能基因-腺苷酰硫酸(APS)还原酶基因作为指示基因,通过实时定量PCR的方法检测了12名重度肥胖症患者在进行膳食干预过程中随着体重的降低,肠道内SRB的数量变化,同时以16S rRNA基因对肠道内总菌进行定量来计算SRB占总菌的相对比例。结果膳食干预过程中,随着患者体重的显著降低,其肠道内SRB占总菌的比例也显著下降。在维持期,患者体重仍和干预前有显著差异,但较干预期有所回升;其体内SRB含量也显著低于干预前,但相比干预期,有所上升。结论研究结果提示肠道菌群中SRB细菌与肥胖的发展有密切关系,为后续研究SRB细菌的功能和作用机理奠定了基础。

肠道硫酸盐还原菌DGGE分析技术的建立

目的建立分析肠道内硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)组成的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gra-dient gel electrophoresis,DGGE)技术,并用于分析10例健康人粪便样品中的SRB组成。方法从GenBank中下载13株脱硫弧菌科细菌的腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因(aprA)的序列,利用Clustal X、Simulated PCR(SPCR)软件比较、评估了2对针对aprA基因的引物(AprA-3-FW/APS-RV和AprA-1-FW/AprA-5-RV)用于扩增粪便样品中的SRB的特异性。确定PCR引物和条件,进一步摸索并建立DGGE分析体系。结果 Clustal X和SPCR软件分析的结果均表明引物AprA-3-FW/APS-RV优于AprA-1-FW/AprA-5-RV。实际PCR的结果也显示AprA-1-FW/AprA-5-RV扩增效率低并有非特异扩增。建立DGGE体系,对10例健康人肠道中SRB的分析显示,每个个体肠道中SRB的种类有1到5种不等。结论基于aprA序列的DGGE技术是分析肠道SRB组成的有效方法。