晚期肺腺癌胸苷酸合成酶和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与培美曲塞化疗的临床效果

目的探讨晚期肺腺癌胸苷酸合成酶(TS)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的表达及与培美曲塞联合铂类治疗的疗效分析。方法入组晚期肺腺癌患者58例,25例检测TS和MTHFR基因的多态性并分析其与化疗疗效及无进展生存期的关系。结果 58例患者的疾病控制率(DCR)38%,中位无进展生存期(PFS)8.1个月。TS基因多态性2R/2R型16%、2R/3R型32%、3R/3R型52%;3R/3R型、2R/2R+2R/3R型DCR分别为53.8%和91.7%(P=0.046);PFS分别为9.3和10.4个月(P>0.05)。MTHFR基因多态性C/T型52%,C/C型40%,TT型8%;MTHFR基因C/C型、C/T+T/T型DCR分别为70.0%和73.3%;PFS分别为10.0和9.7个月(P> 0.05)。结论 TS基因多态性与培美曲塞联合铂类治疗晚期肺腺癌DCR可能相关,而与PFS无相关性;MTHFR基因多态性与培美曲塞联合铂类治疗晚期肺腺癌DCR、PFS未发现相关性。

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因,即腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因,所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白作鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783bp,始于ATG,止于TAG,预测的等电点和相对分子质量分别为7.75和29×103,目的基因与Genbank腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55×103见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因。

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆、表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因:腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因。将所得片段与p GEX-4t-1(+)载体连接,转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白进行鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800 bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783 bp,启始于ATG,终止于TAG,预测的等电点及分子量分别为7.75、28975.44,目的基因与Genbank金葡腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55 k D左右见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因,为其功能研究提供了物质基础。

油田硫酸盐还原菌APS-MPN-PCR快速定量检测方法

为了解决现有油田污水中硫酸盐还原菌检测周期长、检测费用较高的问题，应用聚合酶链式反应（PCR）技术与倍比稀释法（MPN）相结合的APS-MPN-PCR法，对硫酸盐还原菌进行快速定量检测．从污水中制备了直接用于PCR扩增的菌液，保证了定量检测的准确性；建立以腺苷酰硫酸还原酶基因（APS）为靶位点的通用探针APS7F和APS8R的反应体系和扩增条件．研究结果表明，与液体稀释培养法相比，该方法检测灵敏度提高了两个数量级，操作时间缩短（整个检测过程只需要3～4h），检测费用也降低．该方法检测结果非常稳定，真实的表征了污水中实际的SRB菌数量，可以在生产中应用．

硫酸盐还原菌去除铅的实验研究

考查了初始p H值、反应温度、接种量等对硫酸盐还原菌菌株的生长和对重金属铅去除效果的影响,应用X射线衍射(XRD)、表面能量色谱分析(EDS)对沉淀物进行了表征。结果表明,该菌株生长及去除铅的最佳条件为:p H=8.0,温度30℃,接种量10%,该条件下的去除率高达99.79%。所得到的沉淀物为硫化铅,立方方铅矿结构,结晶度良好。进一步研究了最佳条件下不同初始浓度硝酸铅对硫酸盐还原菌细胞中亚硫酸盐还原酶(SiR)和腺苷酰硫酸还原酶(APS)比活力的影响。结果表明,硝酸铅质量浓度低于950mg/L时,亚硫酸盐还原酶和APS还原酶比活力受到轻微抑制,当硝酸铅质量浓度为1 100 mg/L时,其比活力受到明显的抑制。重金属铅对亚硫酸盐还原酶比活力抑制作用相对明显。

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。

ABCA1基因R219K多态性对AMI患者他汀药物调脂效应的影响

目的:研究三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)R219K基因多态性和AMI患者血脂水平关系以及他汀药物调脂疗效与患者不同基因型的关系。方法:AMI患者(150例),其中ST段抬高型心肌梗死120例,非ST段抬高性心肌梗死30例,对照组(100例)为门诊健康体检者,均清晨空腹采血,测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)。并采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFIP)方法对R219K基因多态性进行检测,AMI患者给与普伐他汀40 mg/d,12周后重复测定上述血脂水平。结果:ABCA1基因的R219K多态性基因型频率和等位基因频率在对照组和AMI组相似(P>0.05);AMI患者中RR基因型较KK基因型具有明显升高的血清TG水平和较低的HDL-C水平(P<0.05);KK基因型患者较RR基因型患者相比,普伐他汀治疗明显增加HDL-C水平(P<0.05)。结论:ABCA1基因的R219K多态性与血脂水平相关,并且可影响AMI患者HDL-C水平对普伐他汀的治疗效果。

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的检测真核表达克隆pcDNA3．1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（NMNAT1）的水平和有效性。方法采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段，构建到T载体中，并转接到pcDNA3．1中；同时设计引物进行全基因测序；采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因，通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3．1-NMNAT1的表达水平和表达有效性，并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法。结果成功钓取了小鼠源NMNAT1基因，测序结果显示与数据库序列完全匹配，pcDNA3．1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系，48h以后收取细胞，经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测，结果显示表达克隆pCDNA3．1-NMNAT1能同时在tuRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因。结论成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA，与Pubmed序列完全一致，并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质。

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。

NMNAT1基因对体外原代培养神经元树突发育的影响

目的评价NMNAT1基因对原代培养小鼠神经元树突发育的影响。方法我们在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,我们上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元树突的形态。在所有的功能试验中,把FK-866(CAS658084-64-1)一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓树突生长和减少树突的数目。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

二丁酰环磷酸腺苷诱导脆性X智力低下一号基因重启及再表达的研究

目的探讨二丁酰环磷酸腺苷(db-CAMP)对细胞内脆性X综合征FMR1基因再激活的可能性。方法利用硝普钠(SNP)封闭FMR1基因表达,建立脆性X综合征的细胞模型,用Real-time PCR及Western Blot的方法分别从基因及蛋白水平检测二丁酰环磷酸腺苷对FMR1基因封闭后的再激活作用。结果发现db-CAMP可以激活封闭的FMR1基因,0.5umol/LdbCAMP作用12h可使FMR1m RNA表达量上升为封闭组的9.4倍,达到正常细胞的水平;在蛋白水平,0.5mmol/L的db-CAMP作用72h时可提高FMRP表达量1.11倍。结论通过给予外源性c AMP(db-CAMP)可有效地诱导封闭FMR1基因的转录重启与蛋白水平的再表达,这为脆性X综合征的替代治疗提供一种新的思路与药物途径。

S-腺苷酰-L-甲硫氨酸对肝癌细胞HepG2增殖、迁移及癌基因C-myc表达的影响

目的探讨S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAMe)对肝癌细胞HepG2增殖、迁移及癌基因C-myc表达的影响,为深入研究SAMe在肝癌治疗中的作用奠定基础。方法体外培养HepG2细胞,MTT法检测不同浓度SAMe作用不同时间对HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕法检测最适浓度SAMe对HepG2细胞迁移能力的影响;RT-PCR、免疫细胞化学法及Westernblot法检测SAMe对HepG2细胞癌基因C-myc转录、蛋白定位及表达的影响。结果终浓度为15.0μmol/L的SAMe处理细胞5d,细胞抑制率达54.6%,且抑制作用呈时间与剂量依赖性;经15.0μmol/LSAMe处理的细胞迁移能力明显下降,愈合速率为对照组的76.78%;细胞中癌基因C-myc的转录和蛋白表达均明显下降,蛋白定位无明显变化。结论 SAMe可通过降低C-myc的表达,抑制HepG2细胞的增殖和迁移,为肝癌治疗性药物的研究提供了一个新的方向。

滇重楼3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶PpHMGR基因的克隆及分析

为了克隆滇重楼编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因,并分析其在滇重楼不同组织中差异表达。本研究采用RT-PCR的方法从滇重楼根茎中克隆到编码HMGR的基因全长序列,用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析,并对该蛋白进行相似性检索、构建进化树;利用实时荧光定量的方法检测该基因在滇重楼不同组织中的差异表达。结果获得了全长1 494 bp的ORF,编码497个氨基酸,命名为PpHMGR(GenBank登记号:MG601751)。PpHMGR编码的蛋白含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。PpHMGR在根茎的表达量明显高于叶片、茎和芽,其中在3年生根茎的表达量又明显高于1年和5年生根茎。本研究从滇重楼中克隆了PpHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探讨滇重楼皂苷的合成生物学研究提供了科学依据。

耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验指导肺鳞状细胞癌二线化疗的临床研究

目的：探讨耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验（ATP-TCA）对肺鳞状细胞癌二线化疗的指导意义，为临床治疗提供参考。方法收集组织病理学或细胞学确诊的、行NP方案一线化疗出现病情进展的肺鳞状细胞癌患者150例，采用实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR）行耐药基因切除修复交叉互补基因1（ERCC1）mRNA、核苷酸还原酶M1亚基（RRM1）mRNA检测及ATP-TCA。两种方法检测结果同时显示对吉西他滨＋顺铂（GP）化疗方案敏感者，行二线GP方案全身化疗（GP组）；两种方法检测结果同时显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线多西他赛＋顺铂（DP）化疗方案（DP组），两组均行2～4个周期全身化疗。随访胸部CT，观察化疗有效率、中位无进展生存（PFS）及中位生存期。结果GP组有效率为36.2%（17／47），DP组为28.1%（26／92），两组差异有统计学意义（χ2＝4.274，P＜0.05）；GP组与DP组中位PFS时间分别为4.2个月（95%CI 3.485～5.348个月）和3.6个月（95%CI 2.685～4.648个月），差异有统计学意义（P＜0.05）；GP组与DP组中位生存期分别为9.6个月（95%CI 8.283～10.637个月）和8.9个月（95%CI 7.384～9.648个月），差异无统计学意义（P＞0.05）。结论耐药基因检测联合ATP-TCA对于晚期肺鳞状细癌二线化疗方案的选择有一定的指导意义。

重度肥胖症患者膳食干预前后肠道内硫酸盐还原菌的定量检测

目的检测重度肥胖症患者膳食干预过程中,肠道内硫酸盐还原菌(SRB)的数量变化,为进一步研究SRB与肥胖的关系提供参考。方法以SRB基因组中的重要功能基因-腺苷酰硫酸(APS)还原酶基因作为指示基因,通过实时定量PCR的方法检测了12名重度肥胖症患者在进行膳食干预过程中随着体重的降低,肠道内SRB的数量变化,同时以16S rRNA基因对肠道内总菌进行定量来计算SRB占总菌的相对比例。结果膳食干预过程中,随着患者体重的显著降低,其肠道内SRB占总菌的比例也显著下降。在维持期,患者体重仍和干预前有显著差异,但较干预期有所回升;其体内SRB含量也显著低于干预前,但相比干预期,有所上升。结论研究结果提示肠道菌群中SRB细菌与肥胖的发展有密切关系,为后续研究SRB细菌的功能和作用机理奠定了基础。

肠道硫酸盐还原菌DGGE分析技术的建立

目的建立分析肠道内硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)组成的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gra-dient gel electrophoresis,DGGE)技术,并用于分析10例健康人粪便样品中的SRB组成。方法从GenBank中下载13株脱硫弧菌科细菌的腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因(aprA)的序列,利用Clustal X、Simulated PCR(SPCR)软件比较、评估了2对针对aprA基因的引物(AprA-3-FW/APS-RV和AprA-1-FW/AprA-5-RV)用于扩增粪便样品中的SRB的特异性。确定PCR引物和条件,进一步摸索并建立DGGE分析体系。结果 Clustal X和SPCR软件分析的结果均表明引物AprA-3-FW/APS-RV优于AprA-1-FW/AprA-5-RV。实际PCR的结果也显示AprA-1-FW/AprA-5-RV扩增效率低并有非特异扩增。建立DGGE体系,对10例健康人肠道中SRB的分析显示,每个个体肠道中SRB的种类有1到5种不等。结论基于aprA序列的DGGE技术是分析肠道SRB组成的有效方法。

瑞舒伐他汀对内皮细胞中组织因子途径抑制物表达的影响

目的探讨瑞舒伐他汀对组织因子途径抑制物(TF-PI)表达的调节作用及机制。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予多种剂量的瑞舒伐他汀和(或)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂与激活剂处理细胞,利用实时定量PCR、Western blot技术检测内皮细胞中TFPI表达的变化。结果 TNF-α下调内皮细胞中TFPI的的表达水平,而这一作用被瑞舒伐他汀所阻断。而且,瑞舒伐他汀呈时间及剂量依赖性上调TFPI的mRNA与蛋白水平。AMPK抑制剂———Compoud C则可逆转瑞舒伐他汀对TFPI表达的上调作用,而AMPK激动剂———Aicar则具有与瑞舒伐他汀相似的上调TFPI的作用。结论瑞舒伐他汀通过激活AMPK途径上调血管内皮细胞中TFPI的表达。

高脂饲料诱导的肥胖大鼠肠道内硫酸盐还原菌的定量检测

目的检测高脂饲料诱导大鼠肥胖过程中,大鼠肠道内硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)的数量变化,为研究SRB与肥胖的关系提供参考。方法 20只Wistar大鼠随机分为2组(每组10只),一组饲喂高脂饲料(HFD组)18周,另一组饲喂正常饲料(NCD组,即对照组)18周。以编码腺苷酰硫酸还原酶α亚基的基因(aprA)作为分子标记,通过荧光定量PCR的方法检测两组大鼠在0、8和18周,肠道内SRB的数量变化;同时,以16S rRNA基因作为标记基因定量大鼠肠道内总菌的数量,以计算肠道内SRB在总菌中的比例变化。结果分组饲喂8周后,高脂饲料饲喂组大鼠的体重与正常饲料组相比显著升高。对SRB的定量结果显示,饲喂8周和18周,高脂饲料组大鼠肠道内SRB的数量和含量与正常饲料组相比显著升高。结论大鼠肠道中的硫酸盐还原菌与饮食诱导的肥胖密切相关,为进一步研究SRB在肥胖及其相关代谢疾病的发生发展中的作用提供了依据。

异常血流动力对HUVEC胆固醇代谢的影响及其致AS的机制

目的通过研究异常血流动力对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)摄取、合成及外排胆固醇的影响,进一步探讨异常血流动力和胆固醇代谢在动脉粥样硬化(AS)形成机制中的作用。方法待细胞生长良好后,换用新的含有低密度脂蛋白(LDL)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的培养液,同时施加作用力。按照细胞所受作用力不同,随机分为应力组、壁面压力组、对照组A和对照组B。在各自作用力的作用下培养24 h。收集细胞和培养液待用。用酶法检测4组培养液中LDL浓度和胆固醇浓度。用高效液相色谱法检测HUVEC内和细胞膜中胆固醇的含量。分别用实时定量RT-PCR法和蛋白免疫印迹法检测低密度脂蛋白受体(LDLR)、羟-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CR)、ABCA1的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组B相比较,应力组培养液中LDL含量明显减少,细胞内胆固醇含量明显增高,而且LDLR和HMG-CR的mRNA和蛋白表达明显增高。壁面压力组培养液中胆固醇含量明显增高,细胞膜中胆固醇含量明显降低,而且ABCA1的mRNA和蛋白表达明显增高。对照组A培养液中LDL含量明显降低,胆固醇含量明显增高,而且LDLR、HMG-CR和ABCA1的mRNA和蛋白表达均明显增高。结论应力通过上调LDLR和HMG-CR的mRNA和蛋白的表达促进VEC摄取LDL和合成胆固醇,壁面压力通过上调ABCA1的mRNA和蛋白的表达促进内皮细胞膜外排胆固醇。异常血流动力使血管内皮细胞胆固醇代谢平衡紊乱进而引起AS。

代谢病

0101256 腺苷脱氨基酶缺损的基因治疗临床研究[日]/崎山幸雄//Biotherapy.-1999,13(5).-415 冀医情0101257 单有亚硫酸盐氧化酶缺乏:一个家庭两个病例的复习/Edwards M