金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因,即腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因,所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白作鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783bp,始于ATG,止于TAG,预测的等电点和相对分子质量分别为7.75和29×103,目的基因与Genbank腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55×103见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因。

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆、表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因:腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因。将所得片段与p GEX-4t-1(+)载体连接,转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白进行鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800 bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783 bp,启始于ATG,终止于TAG,预测的等电点及分子量分别为7.75、28975.44,目的基因与Genbank金葡腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55 k D左右见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因,为其功能研究提供了物质基础。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对体外原代培养神经元轴突发育的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)1基因对体外原代培养小鼠神经元轴突发育的影响。方法在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元轴突形态。在所有的功能试验中,把一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂FK-866(CAS658084-64-1)用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓轴突生长,同时引起轴突分支的减少。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。

人重组烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2的表达、纯化及酶活力测定

目的:通过大肠杆菌体系诱导表达烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2),并测定纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法:在大肠杆菌BL21(DE3)体系优化条件下诱导表达NMNAT2重组蛋白,利用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化,Western blot法进行鉴定,并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD,测定其酶活性。结果:人重组质粒NMNAT2-p ET-24a可以在大肠杆菌BL21(DE3)体系中诱导表达。诱导条件为:LB培养液(卡那霉素,15μg/m L)中37℃,IPTG(1.0 m M)诱导表达4 h。纯化获得的NMNAT2重组蛋白具有较高的酶活性。结论:NMNAT2-p ET-24a可在大肠杆菌BL21(DE3)体系中稳定表达,优化条件下可获得较高活性的纯化NMNAT2重组蛋白,可用于神经保护功能及酶蛋白的活性调控研究。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对原代培养小鼠神经元活力的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶I（NMNATl）基因对原代培养小鼠神经元活力的影响。方法取原代培养神经元，分成正常对照组、过表达NMNATl慢病毒感染组、RNA干扰慢病毒感染组，后两组分别感染小鼠NMNATl基因的过表达和RNA干扰慢病毒颗粒以上调和下调NMMT1基因的表达水平。应用MTT染色观察各组原代培养小鼠神经元活力的变化。结果与正常对照组原代培养小鼠神经元活力比较，过表达NMNAT1慢病毒感染组神经元的细胞活力显著增强，而RNA干扰慢病毒感染组神经元的细胞活力受到严重干扰，差异有统计学意义（P=0．025．P=0．027）。结论NMNAT1基因在神经元发育过程中起重要作用，其缺失可能导致中枢神经系统的神经退化。

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的检测真核表达克隆pcDNA3．1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（NMNAT1）的水平和有效性。方法采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段，构建到T载体中，并转接到pcDNA3．1中；同时设计引物进行全基因测序；采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因，通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3．1-NMNAT1的表达水平和表达有效性，并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法。结果成功钓取了小鼠源NMNAT1基因，测序结果显示与数据库序列完全匹配，pcDNA3．1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系，48h以后收取细胞，经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测，结果显示表达克隆pCDNA3．1-NMNAT1能同时在tuRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因。结论成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA，与Pubmed序列完全一致，并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对慢性帕金森病小鼠模型黑质中酪氨酸羟化酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对慢性帕金森病(PD)小鼠模型(C57BL/6小鼠)黑质中酪氨酸羟化酶(TH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)表达的影响。方法利用重组慢病毒转染1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备慢性PD小鼠模型。依据不同处理方式分为3组:对照组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射空白对照重组慢病毒(LV-GFP),1周后腹腔注射生理盐水];MPTP组(经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射LVGFP,1周后建立MPTP慢性PD模型);NMNAT1组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射NMNAT1基因的过表达重组慢病毒(LV-NMNAT1),1周后建立MPTP慢性PD模型]。采用Western blot法检测3组小鼠黑质中TH及caspase-3半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1组黑质中TH蛋白表达量较MPTP组高(t=7.985,P<0.001),caspase-3蛋白表达量较MPTP组低(t=8.901,P<0.001)。结论 NMNAT1能增加TH表达发挥一定的神经保护作用,并通过减少caspase-3表达水平参与抗细胞凋亡。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对MES23.5帕金森病细胞模型过氧化氢酶及酪氨酸羟化酶蛋白表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对帕金森病(PD)细胞模型(MES 23.5细胞)过氧化氢酶(CAT)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法利用质粒转染或SiRNA技术分别处理MES 23.5细胞,依据不同处理方式分为6组:pEGFP组、pEGFP+MPP+组、NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1组、pMagic4.1+MPP+组和NMNAT1-RNAi+MPP+组。采用Western blot法检测各组MES23.5细胞的CAT和TH半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1+MPP+组CAT表达量和TH蛋白表达量均升高;NMNAT1呈低表达的pEGFP+MPP+组、NMNAT1-RNAi+MPP+组CAT蛋白表达也有所降低,TH蛋白表达量下降。结论 NMNAT1通过增加CAT表达水平参与抗氧化应激,并且增加TH表达,具有一定的神经保护作用。

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。

NMNAT1基因对体外原代培养神经元树突发育的影响

目的评价NMNAT1基因对原代培养小鼠神经元树突发育的影响。方法我们在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,我们上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元树突的形态。在所有的功能试验中,把FK-866(CAS658084-64-1)一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓树突生长和减少树突的数目。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

NMNAT1对MES23.5帕金森病细胞模型Caspase8及TH蛋白表达影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对帕金森病(PD)细胞模型MES23.5细胞Caspase8、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达的影响。方法将MES23.5细胞分为6组,pEGFP组以NMNAT1高表达(NMNAT1-OE)空载质粒转染MES23.5细胞;pEGFP+MPP^+组以NMNAT1-OE空载质粒转染MES23.5细胞后,再向细胞内加入1-甲基-4-苯吡啶离子(MPP^+)100mmol/L;NMNAT1-OE+MPP^+组以NMNAT1-OE质粒转染MES23.5细胞,再向细胞内加入MPP^+100 mmol/L;pMagic4.1组以NMNAT1RNAi空载质粒转染MES23.5细胞;pMagic4.1+MPP^+组以NMNAT1 RNAi空载质粒转染MES23.5细胞,再加入100 mmol/L的MPP^+;NMNAT1-RNAi+MPP^+组以NMNAT1RNAi质粒转染细胞后,再加入100mmol/L的MPP^+。应用Western印迹分析方法检测各组TH、Caspase8蛋白表达。结果pEGFP+MPP^+组、pEGFP组、NMNAT1-OE+MPP^+组TH表达依次升高,Caspase8表达依次降低,3组间比较差异有显著性(F=18.46、13.26,P<0.05)。pMagic4.1组、pMagic4.1+MPP^+组、NMNAT1-RNAi+MPP^+组TH表达依次降低,差异有显著性(F=11.78,P<0.05);pMagic4.1+MPP^+组Caspase8表达最高,NMNAT1-RNAi+MPP^+组次之,pMagic4.1组最低,差异有显著意义(F=17.65,P<0.05)。结论 NMNAT1可能通过抑制Caspase8的表达、同时增加TH的表达而发挥神经保护作用。

结直肠癌组织中NMNAT2蛋白的表达及其临床意义

目的探讨结直肠癌组织中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)蛋白的表达及其临床意义。方法选择2015年1月至2017年12月收集的120例结直肠癌及癌旁组织标本为研究对象,给予常规固定-包埋-切片处理后,行免疫组化检测结直肠癌组织中NMNAT2蛋白,分析其表达情况及临床意义。结果 NMNAT2蛋白表达定位主要是结直肠癌细胞胞质,且结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达阳性率高于癌旁正常结直肠组织(P<0.05)。不同性别、年龄、形态类型、组织类型、分化程度、肿瘤大小的结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同浸润深度、淋巴结转移、TNM分期的结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌组织中NMNAT2蛋白特异性高,且直接参与结直肠肿瘤的发生、发展,可以作为结直肠癌的新促癌基因,成为临床新型结直肠癌诊断、治疗靶点。

NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢影响的研究

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)上调造成神经元损伤的机制。方法HEK293T细胞过表达NMNAT2后,检测细胞糖酵解水平的改变,同时免疫印迹检测糖酵解限速酶和线粒体能量代谢相关蛋白表达水平的变化以及AMPK活性的改变。之后通过立体定位注射技术将腺相关病毒打入小鼠海马CA1区上调NMNAT2。免疫印迹检测在体过表达NMNAT2后上述细胞能量代谢相关蛋白的变化。结果HEK293T细胞过表达NMNAT2后,细胞外液的乳酸含量下降,6-磷酸果糖激酶-1和Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。在体过表达NMNAT2后,Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。结论 NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢的不利影响可能是造成神经元损伤的机制之一。