以高热稳定性的腺苷酸基琥珀酸合成酶为催化剂大量合成腺苷酸基琥珀酸(盐)

目的实现腺苷酸基琥珀酸(盐)(S-AMP)的大规模合成,为开展药物学等研究提供原料。方法以pET-28-a为表达载体,利用大肠杆菌表达古细菌Pyrococcus horikoshii OT3来源的腺苷酸基琥珀酸合成酶(PhAdSS),利用Ni-NTA层析柱纯化后作为催化剂在实验室内开展这种微生物体内合成S-AMP的反应。用Bradford法测定纯化后PhAdSS的浓度。利用硅胶薄层层析检测反应进度。用硅胶柱层析法和重结晶法纯化S-AMP,利用质谱法测定合成品中S-AMP的分子量,利用紫外分光光度法测定合成品内S-AMP的含量及回收率。结果经纯化后从1 L的自动诱导培养基中至少获得20 mg的His-tagged-PhAdSS。将含有10 mmol/L肌苷酸、11 mmol/L L-天冬氨酸、20 mmol/L鸟苷三磷酸、4 mmol/L MgCl_2、2.9μmol/L的His-tagged-PhAdSS溶液于常压环境中,70℃恒温6 h以上可以实现IMP完全转化为S-AMP。纯化后可得到S-AMP的单晶体,利用紫外分光光度法测定的纯度为94%,收率为17%。结论实现了PhAdSS为催化剂的S-AMP的大量合成。

腺苷酸琥珀酸合成酶与其抑制剂的分子机制研究

利用密度泛函B3LYP方法选择6-31G(d)基组对腺苷酸琥珀酸合成酶(AdSS)天然抑制剂及其衍生物的结构进行优化,并对其稳定性进行了分析,同时采用Mulliken键序、原子电荷分布、表观静电势等对AdSS抑制剂及其衍生物电子结构与其生物活性相关性进行了理论研究.基于腺苷酸琥珀酸合成酶(AdSS)与其底物肌苷单磷酸(IMP)复合物的晶体结构以及获得的天然抑制剂衍生物稳定构象,利用分子对接、分子力学优化及常温分子动力学模拟对AdSS酶与天然抑制剂及其衍生物的相互作用复合物结构进行理论预测.结果表明,AdSS酶的系列抑制剂中磷酸根基团和乙内酰脲(Hydantoin)官能团构成药效团模型,识别过程中范德华相互作用能的贡献大于静电相互作用能.

草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶克隆及序列分析

腺苷酸基琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶。研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库为基础,应用PCR、RT-PCR和RACE技术,成功获得了草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的cDNA全长和基因组DNA全长。该基因全长1584 bp,包含一个1449 bp的开放阅读框,编码482个氨基酸,与其他脊椎动物比对显示,其序列具有较高的保守性。草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因组DNA由13个外显子和12个内含子组成,其外显子拼接位点非常保守,遵循GT-AG原则。

腺苷酸琥珀酸合成酶2对肝癌细胞迁移作用的研究

目的探讨腺苷酸琥珀酸合成酶2(adenylosuccinate synthetase isozyme 2,ADSS)在肝癌发生、发展中的作用。方法使用公共数据库及肝癌细胞对ADSS在肝癌中的表达及其对肝癌患者5年生存率的影响进行分析;在HepG 2及LM3细胞中沉默ADSS基因;使用细胞划痕实验及Transwell实验研究ADSS对肝癌细胞的迁移的影响;使用蛋白印迹法检测ADSS沉默细胞中上皮间质转化标志物的表达;检测LM3-Sh-ADSS2基因及代谢产物回补后上皮间质转化标志物及迁移能力改变。结果ADSS在肝癌中表达上调且与患者5年生存率呈负相关;ADSS促进肝癌细胞的迁移;ADSS参与了肝癌细胞的上皮间质转化过程。结论ADSS基因在肝癌中表达量增高并且可能通过参与上皮间质转化过程促进肝癌细胞的转移。

腺苷酸基琥珀酸活化AMPK抑制肝细胞内脂质蓄积的作用机制

目的揭示腺苷酸基琥珀酸(盐)(S-AMP)的生物学新功能。方法以AMP活化蛋白激酶(AMPK)的天然底物AMP为参照,应用表面等离子共振研究S-AMP和AMPK的相互作用特征。分别构建脂质蓄积和糖蓄积的HepG2细胞模型,通过特定浓度的S-AMP和对照药物作用后测定Hep G2细胞内甘油三酯浓度和葡萄糖浓度,研究S-AMP和AMP降脂和降糖的作用规律。用Westernblot研究S-AMP作用HepG2细胞后提高AMPK磷酸化水平及其下游糖、脂质代谢通路中关键蛋白质的表达量变化规律,提出S-AMP的作用机制。最后利用饮食诱导的糖尿病和高血脂症金黄地鼠模型研究S-AMP促进糖脂代谢的药效。结果 S-AMP和AMPKγ亚基形成复合体后提高AMPK磷酸化水平,提高AMPK下游的甘油三酯脂肪酶和乙酰辅酶A羧化酶的表达量和磷酸化。促进葡萄糖分解的PFKFB3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase3 enzyme)蛋白和转化为糖原的蛋白质糖原合成酶的表达量没有明显变化,S-AMP显示出的降脂活性高于同等浓度的洛伐他汀。结论发现了S-AMP降低脂质蓄积的作用机制。

腺苷酸琥珀酸合成酶双基抑制剂类似物的合成及生物活性

以丁内酯为原料,通过缩合、水解、亚胺化、关环、还原、偶联、甲酰化以及脱保护等反应设计并探索了腺苷酸琥珀酸合成酶双基抑制剂类似物的合成方法,目标化合物的结构经1H NMR和HR-ESI-MS数据进行表征.初步生物活性测试结果表明,目标化合物在100μg/m L浓度下对油菜和稗草具有较弱的抑制活性.

初产妇足月前胎膜早破与基质金属蛋白酶-7及OAS1基因多态性的关系

目的遗传因素在未足月胎膜早破(PPROM)发生中起关键作用。文中分析初产妇PPROM与基质金属蛋白酶(MMP)-7、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)1基因多态性的关系。方法回顾性分析2018年5月-2019年7月成都中医药大学附属医院收治的82例PPROM初产妇临床资料(PPROM组);另按1∶1比例选取同期医院分娩的年龄相仿的82例足月妊娠后分娩的初产妇作为对照组。采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RELP)法测定MMP-7、OAS 1基因型及等位基因分布;酶联免疫吸附试验法测定两组血清MMP-7表达;放射免疫法测定OAS 1表达。分析MMP-7、OAS 1基因多态性与PPROM的关系。结果PPROM组携带AG型(51.22%)基因型所占比例显著高于对照组(36.59%),差异有统计学意义(P<0.05);携带G型等位基因比例(36.59%)显著高于对照组(21.95%),差异有统计学意义(P<0.05)。PPROM组、对照组OAS 1基因rs10774671位点基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05);PPROM组脐血MMP-7浓度高于对照组(P<0.05),两组OAS1浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。携带MMP-7 rs1156818位点AG基因型可能使PPROM发生风险增加2.128倍(校正OR=2.128,95%CI:1.623~2.788),携带等位基因G可能使PPROM发生风险增加2.149倍(校正OR=2.149,95%CI:1.719~2.387)。结论携带MMP-7(rs1156818位点)等位基因G可能与初产妇PPROM易感性有关;而OAS1 rs10774671位点基因多态性与PPROM无关。

腺苷酸基琥珀酸裂解酶在胃癌中的表达及其临床意义

背景和目的:腺苷酸基琥珀酸裂解酶(ADSL)是嘌呤从头生物合成的必需酶,参与调控肿瘤嘌呤核苷酸、细胞周期和细胞增殖重要功能。然而,它在胃癌(GC)中的表达与作用仍不十分清楚。因此,本研究探讨ADSL在GC组织中的表达与作用以及与局部晚期GC新辅助化疗的关系。方法:利用TCGA队列中的配对GC和正常组织表达数据,通过TNM plot、人类蛋白图谱、UALCAN、STRING数据库,分析ADSL表达及临床意义。用荧光定量PCR检测24例在湖南省肿瘤医院接受新辅助化疗(SOX方案5例、XELOX方案7例、FLOT方案12例)的局部晚期GC患者的组织标本中ADSL表达。结果:数据库分析结果显示,与正常胃组织相比,GC组织中的ADSL mRNA和蛋白表达明显性增加,且ADSL过表达患者与预后较差。ADSL表达与磷酸核糖甲酰基甘氨脒合酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶等呈明显正相关。ADSL表达涉及p53信号通路、Wnt信号通路、miroRNA(microRNA)调控以及细胞周期调控。行不同新辅助化疗方案后的GC组织中ADSL mRNA表达均明显高于各自的癌旁组织,相对另两种方案,行FLOT方案的患者临床客观缓解率较高,GC组织ADSL mRNA表达较低。结论:ADSL在GC组织中表达升高,且与不良预后密切相关。ADSL有望成为局部晚期GC新辅助化疗疗效的标志物。

浮萍棘尾虫Adss基因克隆及表达载体构建

为研究腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthase,简称Adss)在原生动物中的作用,对浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)腺苷酸基琥珀酸合成酶Adss基因进行PCR克隆,获得全长为1396 bp左右的序列,其编码458个氨基酸,保守结构域含有一个P-loop NTPase结构域,蛋白结构预测Adss蛋白是由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲组成的复杂结构。多重序列比对和系统进化分析显示浮萍棘尾虫Adss蛋白与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫等纤毛虫同源性较高。通过克隆浮萍棘尾虫Adss基因的启动子序列,并采用增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因,构建了启动子序列调控的表达载体pEGFP-N1-Adss,通过转染细胞确定浮萍棘尾虫Adss蛋白定位于细胞质中。文章报道了原生动物纤毛虫Adss基因,证实浮萍棘尾虫Adss蛋白属于典型的真核生物Adss,为进一步揭示Adss在单细胞真核生物中的作用机制提供了新的参考。

含咪唑啉2，4-二酮的新型磷酰胺酯类化合物的合成和生物活性

在合成含咪唑啉2,4-二酮磷酸酯和磷酰胺类化合物的基础上,根据Hydantocidin在植物体内的作用形式是Hydantocidin 5'-phosphate的特点,将5-[4-羟基-3-硝基-苯(苄)基]-2,4-咪唑啉二酮中间体与O,N-二烷基硫代磷酰氯反应合成得到了18个结构新颖的O-烷基-N-烷基-5-[4-羟基-3-硝基-苯(苄)基]-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺酯类化合物,其结构通过IR,1H NMR,31P NMR和元素分析表征.初步生物测定结果表明,化合物O-乙基(丙基)-N-异丙基-5-(4-羟基-3-硝基苄基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺酯(B10,B16)在100μg/mL浓度下对油菜的抑制率为64.1%和69.6%,O-甲基-N-正丁基-5-(4-羟基-3-硝基苄基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺酯(B15)对蚜虫和小菜蛾均表现了良好的杀虫活性,在300μg/mL浓度下24 h的校正死亡率分别为100%和95%.

新型含咪唑啉2,4-二酮的磷酰胺类化合物的合成和生物活性

在合成含咪唑啉2,4-二酮磷酸酯和磷酰胺酯类化合物的基础上,将5-[4-氨基-苯(苄)基]-2,4-咪唑啉二酮中间体与O,O-二烷(芳)基硫代磷酰氯反应合成得到了38个结构新颖的O,O-二烷(芳)基-5-[4-氨基-苯(苄)基]-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺类化合物,其结构通过1H NMR,31P NMR,IR,元素分析和X射线衍射表征.化合物9b:C14H20N3O3PS21/3H2O,Mr=379.43,三斜晶系,P-1空间群,a=0.82092(5)nm,b=1.79810(14)nm,c=2.0153(2)nm,α=72.289(8)°,β=79.355(7)°,γ=77.288(6)°,V=2.7421(4)nm3,Dc=1.379 g/cm3,Z=6,F(000)=1196,μ(Mo Kα)=0.397 mm-1,S=1.031,final R=0.0426,wR=0.0797.初步生物测定结果表明化合物O,O-二甲基-5-(4-氨基苯基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺(7a),O-乙基-O-苯基-5-(4-氨基苄基)-2-硫代-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺(9n)和O,O-二甲基-5-(3-氨基苯基)-2-硫代-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酰胺(11a)在100μg/mL浓度下对油菜的抑制率分别为75.4%,80.5%,81.7%,其中11个化合物对蚜虫的LD50值在182.41~368.52μg/mL之间,表现了良好的杀虫活性.

新型含咪唑啉2,4-二酮的(硫代)磷酸酯类化合物的合成和生物活性测定

以对羟基苯基和对羟基苄基咪唑啉2,4-二酮羧酸酯类化合物为二次先导结构,根据Hydantocidin在植物体内的作用形式是Hydantocidin 5'-Phosphate的特点,将3种对羟基苯(苄基)-2,4-咪唑啉二酮中间体与(硫代)磷酰氯反应合成得到了38个结构新颖的含有2,4-咪唑啉二酮的(硫代)磷酸酯类化合物,其结构通过IR,1H NMR,31P NMR和元素分析表征.初步生物测定结果表明O-乙基-O-苯基-5-(4-羟基苯基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酸酯(B14)和O,O-二苯基-5-(4-羟基苄基)-2-硫代-4-咪唑啉二酮硫代磷酸酯(B25)在100μg/mL浓度下对油菜的抑制率为53.1%和62.7%,化合物O,O-二(邻甲氧基苯基)-5-(4-羟基苯基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酸酯(B7),B14和O,O-二(对甲基苯基)-5-(4-羟基苄基)-2,4-咪唑啉二酮硫代磷酸酯(B17)对蚜虫表现了一定的杀虫活性,在300μg/mL浓度下24 h的校正死亡率分别为52%,51%和69%.

过表达purA基因对腺苷积累的影响

利用穿梭质粒pBE43,在腺苷产生菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL(Xan-+Deam-+8-AGr+SGr)中过表达腺苷生物合成途径中关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(ADSS)的基因purA,研究其对腺苷积累的影响。以腺苷产生菌XGL基因组为模板,扩增出purA基因,将其连接到穿梭载体pBE43上,获得重组质粒pBE43∶∶purA。将重组质粒转化入XGL中,构建新的产生菌XGL-SY。通过逆转录PCR和定量PCR测定purA基因在腺苷产生菌XGL和XGL-SY中的转录量,并利用5L罐发酵实验测定发酵参数的变化。分析发酵对数期的基因转录发现,在添加质粒后,purA基因的转录量提高了约9倍。上罐实验表明改造后的产生菌XGL-SY,菌体生长虽然受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量提高了10.8%。研究结果表明在腺苷产生菌中过表达purA基因可以促进腺苷的积累,这为腺苷工程菌的进一步改造奠定了基础。