草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶克隆及序列分析

腺苷酸基琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶。研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库为基础,应用PCR、RT-PCR和RACE技术,成功获得了草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的cDNA全长和基因组DNA全长。该基因全长1584 bp,包含一个1449 bp的开放阅读框,编码482个氨基酸,与其他脊椎动物比对显示,其序列具有较高的保守性。草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因组DNA由13个外显子和12个内含子组成,其外显子拼接位点非常保守,遵循GT-AG原则。

腺苷酸基琥珀酸裂解酶在胃癌中的表达及其临床意义

背景和目的:腺苷酸基琥珀酸裂解酶(ADSL)是嘌呤从头生物合成的必需酶,参与调控肿瘤嘌呤核苷酸、细胞周期和细胞增殖重要功能。然而,它在胃癌(GC)中的表达与作用仍不十分清楚。因此,本研究探讨ADSL在GC组织中的表达与作用以及与局部晚期GC新辅助化疗的关系。方法:利用TCGA队列中的配对GC和正常组织表达数据,通过TNM plot、人类蛋白图谱、UALCAN、STRING数据库,分析ADSL表达及临床意义。用荧光定量PCR检测24例在湖南省肿瘤医院接受新辅助化疗(SOX方案5例、XELOX方案7例、FLOT方案12例)的局部晚期GC患者的组织标本中ADSL表达。结果:数据库分析结果显示,与正常胃组织相比,GC组织中的ADSL mRNA和蛋白表达明显性增加,且ADSL过表达患者与预后较差。ADSL表达与磷酸核糖甲酰基甘氨脒合酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶等呈明显正相关。ADSL表达涉及p53信号通路、Wnt信号通路、miroRNA(microRNA)调控以及细胞周期调控。行不同新辅助化疗方案后的GC组织中ADSL mRNA表达均明显高于各自的癌旁组织,相对另两种方案,行FLOT方案的患者临床客观缓解率较高,GC组织ADSL mRNA表达较低。结论:ADSL在GC组织中表达升高,且与不良预后密切相关。ADSL有望成为局部晚期GC新辅助化疗疗效的标志物。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶互作蛋白的筛选及其功能分析

通过探究鸡腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase)基因ADSL与其互作基因的调控关系,为进一步研究ADSL在肌肉中高表达的原因和ADSL影响肌肉风味的机制提供参考。本研究构建了鸡(gallus)ADSL基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-ADSL,将pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1质粒分别转染鸡成肌细胞,提取表达成功的细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)联合质谱分析鉴定与鸡ADSL蛋白互作的细胞蛋白,并对结果进行GO功能注释、KEGG通路和蛋白互作网络分析。通过分析筛选出RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10蛋白,检测在ADSL基因过表达和沉默状态下,RPL 4、PDLIM 5、ACTG 1和SRSF 10基因在成肌细胞中的表达情况。结果表明,与ADSL互作的蛋白共94个;生物信息学分析表明,这些蛋白定位于细胞结构体、胞内和含蛋白质的复合物上,它们主要参与细胞进程、生物调节和刺激反应等生物进程。间接免疫荧光结果显示,重组蛋白pEGFP-C1-ADSL主要定位于细胞核和细胞质。ADSL过表达时,成肌细胞内RPL 4基因和PDLIM 5基因的表达下调,ACTG 1和SRSF 10基因的表达上调;当ADSL被沉默后,成肌细胞内RPL 4和ACTG 1基因的表达上调。研究结果丰富了调控风味的ADSL蛋白,为进一步了解ADSL的功能及该基因在肌肉中高表达提供了参考。

寿光鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶ADSL基因的表达与克隆化细胞株的筛选

利用RT-PCR与RACE方法检测寿光鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌8种组织腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）基因mRNA的差异表达水平，构建ADSL基因融合表达载体pGEX-ADSL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆，IPTG诱导表达，通过构建真核表达载体pEGFP-ADSL，利用脂质体介导法转染寿光鸡成纤维细胞，并进行阳性细胞的克隆化筛选与检测。结果表明：ADSL基因开放阅读框序列长为1455 bp，编码485个氨基酸;5′端非转录调控区具有典型管家基因的特征，在邻近起始密码子-28 bp处发生C→T突变，该突变使该位点变为核呼吸因子2（NRF-2）结合位点;经SDS-PAGE电泳显示，pGEX-ADSL重组融合蛋白在分子量约为80.5 ku处有特异的蛋白条带出现，与预期分子量大小一致，等电点为6.79，纯化后用Western-blot检测为寿光鸡ADSL蛋白。pEGFP-ADSL转染寿光鸡成纤维靶细胞后24、48和72 h，转染率在26.4%~41.2%之间，绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中，随表达量的增加，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状，经药物筛选和克隆化培养，获得表达pEGFP-ADSL融合蛋白的阳性克隆细胞株，经RT-PCR扩增与Western-blot检测确认ADSL融合蛋白基因已经整合到寿光鸡成纤维细胞的基因组中，获得正常表达。研究结果为揭示我国优良地方鸡种的风味基因结构，研究其生物学功能奠定基础。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶(Adsl)基因多态性及其与肌苷酸含量相关研究

腺苷琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一,催化嘌呤核苷酸合成过程中的两个重要反应:(1)由SAC IAR生成AICAR的反应;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆,并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249G→A(TH),717 C→G(TH),985 A→G(TH)仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW),1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH),1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→A la(305),A la→Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。

5个鸡种腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因外显子9 SNP及其与鸡肉肌苷酸含量的相关分析

根据腺苷琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子9的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现9 839位碱基发生了突变,由C突变为A,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,发现突变后引起ADSL基因第273位氨基酸由Pro突变为Thr,为错义突变。经独立性检验,发现基因型频率和基因频率分布与品种有关,但进一步方差分析并没有显示出该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间存在关联。

家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系

根据腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子2的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、白耳鸡、藏鸡以及红色原鸡两个亚种进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现3484位碱基处发生C→T突变。对3种基因型的肌肉肌苷酸含量的最小二乘分析结果显示TT型(突变型)个体的肌肉肌苷酸含量极显著地高于CT型、显著地高于CC型个体,CT型个体也稍高于CC型,但差异不显著,初步推测该位点可能与肌肉肌苷酸含量有关。根据该多态位点的基因频率,基于Nei氏的遗传距离运用NJ聚类法构建系统发生树,进行家鸡与原鸡的亲缘关系分析,结果发现,丝羽乌骨鸡与白耳鸡的亲缘关系最近,藏鸡和中国红原鸡亚种的亲缘关系也较近,中国地方家鸡品种与中国红原鸡亚种的亲缘关系较近,而与泰国红色原鸡的亲缘关系较远,隐性白羽鸡与原鸡亲缘关系最远,初步得出中国家鸡有自己独自的血缘来源的结论。

几种离子对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性和最适pH值的影响

在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ８．０的１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，当离子浓度＜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｋ＋和Ｎａ＋离子是豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的激活剂，其最适浓度约为７５ｍｍｏｌ／Ｌ，可分别提高酶活性４０％和３５％。Ｍｇ２＋离子是ＡＳＡＬ的抑制剂，能拮抗Ｋ＋和Ｎａ＋离子的激活效应。ＨＰＯ二４离子可显著降低酶活性，抑制效应与ＨＰＯ二４离子浓度呈正相关。在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ６．６～８．０的１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为７．４，而在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ７．４～８．６的Ｔｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为８．２。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因适用性进化分析

采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以肝脏总RNA为模板,对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)编码区序列进行克隆和测序;并结合Gen-Bank中已提交的家鸡、鱼类、哺乳动物和人类等ADSL基因序列,采用基于最大似然法的密码子置换模型分析ADSL基因编码区序列在进化过程中承受的选择压力。结果RT-PCR方法准确获得了泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡ADSL基因编码区序列,全长为1 380bp。"分支特异模型"检验结果表明,ADSL基因在不同物种进化过程中较为保守,未受到正选择作用。鸡ADSL基因序列的"位点特异模型"检验未发现正选择位点。研究结果有助于了解鸡ADSL基因的结构及进化历程。

甘油对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性的影响

】在缓冲液中添加１５％（Ｖ／Ｖ）甘油可使腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的活性提高２４％，对防止ＡＳＡＬ变性失活的效果显著。在４℃静置８，２３和５２ｈ后，ＡＳＡＬ活性分别为原活性的９３％，７４％和６４％，而不加甘油的对照，ＡＳＡＬ活性仅分别为原活性的３０％，３％和０。

低黏木薯辛烯基琥珀酸淀粉钠生产工艺条件

研究了水相法酶解辛烯基琥珀酸淀粉钠工艺中各参数变化,包括酯化反应p H、温度、时间、酸酐添加量以及酶解反应酶添加量、酶解时间、酶解p H对成品的影响,同时探究了酶解酯化的工艺顺序。结果表明:采用先酯化后酶解的工艺顺序,酯化反应最佳条件为p H=8,反应温度25~30℃,反应时间6~8 h;酶解反应最佳条件为酶解p H=5.8~6.0,反应温度25~30℃,反应时间3~4 h,灭活p H=3时灭活时间不少于0.5 h。

辛烯基琥珀酸淀粉酯的制备及其酶法降解的研究

以蜡质玉米淀粉为原料,辛烯基琥珀酸酐为亲核试剂,用正交试验方法确定了在不同条件下,制备辛烯基琥珀酸淀粉酯的最佳工艺参数,着重研究了酯化反应条件对反应取代度的影响。实验结果表明:在辛烯基琥珀酸酐添加量(淀粉干基重的3%)不变的条件下,淀粉乳的浓度、反应温度、反应体系pH值、反应时间对反应取代度均有较大影响。对制备的淀粉酯中的辛烯基琥珀酸酐残留量进行了测定,结果表明,利用本文确定的最佳反应条件制得的淀粉酯辛烯基琥珀酸残留量低于规定标准。利用α-淀粉酶对制得的淀粉酯进行了降解处理,探讨了利用不同的酶解时间,获得不同DE值样品的酶解条件。利用最佳工艺条件,进行了辛烯基琥珀酸淀粉酯的中试放大并获得了预期产品。

辛烯基琥珀酸酶解淀粉酯的性质和显微结构研究

采用傅里叶红外光谱、X射线衍射、紫外可见光谱、激光纳米粒度仪和扫描电镜分析了自制的辛烯基琥珀酸酶解淀粉酯(EOSS)的性质和结构。轻度酶解淀粉经辛烯基琥珀酸接枝改性后,反应只引入辛烯基琥珀酸基团;酯化作用主要发生在无定形区,而对淀粉颗粒的晶型无影响;EOSS具有较高的透明度,且透明度随着取代度的增加而增大;EOSS制成的油脂乳状液粒度小,粒径大小分布均匀,具有较好的乳化性和乳化稳定性;以EOSS为壁材,采用喷雾干燥法制得的油脂微胶囊颗粒包埋效果良好。实验结果表明,制备的EOSS具有良好的性质和结构,可作乳化剂和微胶囊壁材。

不同原料制备的酶解辛烯基琥珀酸淀粉酯作微胶囊壁材的性质比较

主要研究了不同原料的酶解辛烯基琥珀酸淀粉酯的制备及其性质特征,着重比较了其粘度、乳化稳定性、包埋能力及作为壁材的微胶囊油脂的贮藏稳定性。

慢性肝病患者血清精氨[基]琥珀酸裂合酶的变化

目的建立自动生化分析仪检测血清精氨[基]琥珀酸裂合酶(ASL)的方法,探讨其对慢性肝病的诊断效能。方法测定149例慢性肝病患者、247例非肝病患者和32例健康对照血清ASL活性,同时测定ALT和AST活性。结果本组病例ASL、ALT和AST水平与健康对照间均存在明显差异;对照组与非肝病患者ASL活性无明显差异(q=0.051,P=0.959);慢性肝病组与非肝病组、健康对照组ASL活性无重叠。ROC曲线显示ASL对判断慢性肝病的敏感性为98.7%,特异性为97.5%(cutoff值=9.2U/L);ALT、AST的敏感性为60.4%和57.7%,特异性仅分别为33.4%和36.6%(cutoff值=40.0U/L)。结论ASL诊断慢性肝病的敏感性和特异性均优于AST和ALT,是慢性肝病诊断的有用指标。

精氨琥珀酸裂解酶及合成酶在人胃癌组织中表达的意义

目的探讨精氨琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨琥珀酸合成酶(ASS)mRNA在人胃癌组织中的表达。方法收集胃癌组织15例及相应癌旁正常组织12例,采用RT-PCR方法分别检测其中ASL及ASSmRNA的表达,了解胃癌组织与癌旁正常组织中可能存在的ASS及ASL表达差异。结果胃癌组织中ASSmRNA的表达低于正常组织,具有统计学差异(P<0.05);但ASL的表达与正常组织相比无显著性差异。结论胃癌组织中ASSmRNA表达水平下降,提示了精氨酸耗竭原理用于胃癌治疗的可行性。

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的 了解精氨琥珀酸裂解酶 (ASL)与乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原启动子 Ⅰ (SpⅠ )的关系 ,研究精氨琥珀酸裂解酶与SPI在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T A克隆法 ,将ASL基因片段连入载体pGEM T。将获得的质粒pGEM T ASL ,与报告质粒pcDNA3 .1(-)分别用KpnI和XhoI双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3 .1(-) ASL ,将重组表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpⅠ瞬时转染HepG2细胞 ,同时转染pCAT3 basic入HepG2细胞 ,作为阴性对照 ,48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性 ,以了解ASL对SpI转录活性的调节作用。结果 构建的真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpI共转染的HepG2细胞中 ,CAT表达活性是CAT3空载体的 3 .3倍 ,是pCAT3 SpⅠ的1.45倍。结论 精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性 ,促进表面抗原基因的表达。

酶解马铃薯辛烯基琥珀酸淀粉酯的制备及性能研究

以马铃薯淀粉为原料,通过单因素实验方法研究湿法工艺、喷雾工艺制备酶解马铃薯辛烯基琥珀酸淀粉酯,并对性能进行研究。确定制备参数:淀粉乳浓度40%、p H值8.9、温度35℃、时间4h、酸酐3%。酶添加量为0.2(U/ml),在此条件下,乳液乳化能力达到保油4.5倍,乳液稳定性48h,<0.1,干粉溶解不托尾,溶解时间30min以内,干粉流动性测定值2.5。

酶解辛烯基琥珀酸淀粉酯制备粉末油脂工艺

利用酶解辛烯基琥珀酸淀粉酯为壁材,以油脂为芯材,制备粉末油脂。研究结果表明,乳化液制备的最佳条件为乳化温度60℃,乳化时间15 min,加水量10倍(相比于固形物)。制备的乳化液经喷雾干燥得到流动性、稳定性良好的粉末油脂。在油脂包埋率方面,以酶解辛烯基琥珀酸淀粉酯为壁材,优于麦芽糊精、玉米淀粉为壁材。

以高热稳定性的腺苷酸基琥珀酸合成酶为催化剂大量合成腺苷酸基琥珀酸(盐)

目的实现腺苷酸基琥珀酸(盐)(S-AMP)的大规模合成,为开展药物学等研究提供原料。方法以pET-28-a为表达载体,利用大肠杆菌表达古细菌Pyrococcus horikoshii OT3来源的腺苷酸基琥珀酸合成酶(PhAdSS),利用Ni-NTA层析柱纯化后作为催化剂在实验室内开展这种微生物体内合成S-AMP的反应。用Bradford法测定纯化后PhAdSS的浓度。利用硅胶薄层层析检测反应进度。用硅胶柱层析法和重结晶法纯化S-AMP,利用质谱法测定合成品中S-AMP的分子量,利用紫外分光光度法测定合成品内S-AMP的含量及回收率。结果经纯化后从1 L的自动诱导培养基中至少获得20 mg的His-tagged-PhAdSS。将含有10 mmol/L肌苷酸、11 mmol/L L-天冬氨酸、20 mmol/L鸟苷三磷酸、4 mmol/L MgCl_2、2.9μmol/L的His-tagged-PhAdSS溶液于常压环境中,70℃恒温6 h以上可以实现IMP完全转化为S-AMP。纯化后可得到S-AMP的单晶体,利用紫外分光光度法测定的纯度为94%,收率为17%。结论实现了PhAdSS为催化剂的S-AMP的大量合成。