金果胃康胶囊对胃癌前病变模型大鼠胃黏膜ULK1/AMPK/mTOR信号通路的影响

目的:探讨金果胃康胶囊对胃癌前病变(PLGC)大鼠UNC-51样激酶1(ULK1)/5’-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法:75只SPF级Wistar大鼠,除空白组外,采用MNNG复合造模法建立PLGC大鼠模型,造模成功后运用随机数字表法分为模型组、叶酸组及金果胃康高、中、低剂量组,每组12只。灌胃给药8周后取材。HE染色观察胃黏膜病理学变化,免疫组化法检测ULK1蛋白表达水平,qPCR检测胃组织AMPK、mTOR mRNA表达水平,Western blot检测胃组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。结果:金果胃康胶囊可显著改善PLGC大鼠胃黏膜萎缩、肠化生、上皮结构、形态紊乱及细胞异型性等病理表现。与模型组比较,金果胃康胶囊能显著上调AMPK、p-AMPK、ULK1的表达水平,下调mTOR、p-mTOR的表达水平(P<0.05),以高剂量组疗效最为显著。结论:金果胃康胶囊可能通过调控ULK1/AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,修复胃黏膜病变,从而起到防治PLGC的作用。

大黄糖络丸通过AMPK/mTOR/ULK1通路调控糖尿病肾病小鼠足细胞自噬的作用机制研究

目的:探究大黄糖络丸(DHT)基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的干预作用。方法:40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组,达格列净组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DHT高、中、低剂量组(3.6、1.8、0.9 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组8只;另取10只C57BL/KSJ-db/dm(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,连续给药10周,1次/d。于给药0、4、8、10周固定时间,禁食不禁水12 h,取尾静脉血检测空腹血糖(FBG);于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量,计算尿白蛋白肌酐比值(ACR);给药10周后,检测各组小鼠24 h尿总蛋白,血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)含量;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK、p-mTOR及p-ULK1蛋白的表达水平,以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62蛋白的表达水平;免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)的表达水平;采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化。结果:与模型组比较,达格列净组和DHT组小鼠FBG、ACR、24 h尿总蛋白均降低,Scr、BUN无统计学差异;肾组织中p-AMPK、p-ULK1表达水平升高,p-mTOR表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高,P62表达水平降低(P<0.01,P<0.05);肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达水平升高(P<0.01,P<0.05);肾脏病理损害减轻;透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加。结论:DHT可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强足细胞自噬,保护肾小球,延缓DN发展进程。

白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响。方法原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞,将其随机分为正常组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度(20μmol/L)白桦脂酸组(BA-L组)、高浓度(40μmol/L)白桦脂酸组(BA-H组)和高浓度(40μmol/L)白桦脂酸+AMPK抑制剂(10μmol/L)Compound C组(BA-H+CC组)。CCK-8法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡。mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪大鼠血管平滑肌细胞的自噬小体。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表达。Western blot实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平。结果与Control组相比,Model组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。与Model组相比,BA-H组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05)。Compound C减弱了白桦脂酸对血管平滑肌细胞自噬和凋亡的促进作用(P<0.05)。结论白桦脂酸可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进冠心病大鼠血管平滑肌细胞的自噬和凋亡。

基于“以方测证”理论从AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路探讨雷公藤多苷诱导卵泡发育不良大鼠模型的中医证候属性

目的:采用雷公藤多苷诱导卵泡发育不良大鼠模型,基于“以方测证”理论从腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子(AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF)信号通路探索该模型的证候属性。方法:将48只具有规律动情周期大鼠随机分为正常组(n=8)和造模组(n=40),造模组大鼠连续灌胃雷公藤多苷混悬液(75 mL·kg^(-1))30 d,造模后将其分为模型组、四物汤组(3.69 g·kg^(-1))、右归饮组(3.11 g·kg^(-1))、左归饮组(7.29 g·kg^(-1))和归肾丸组(10.35 g·kg^(-1)),每组8只。相应药物干预14 d。巴氏染色检测各组大鼠动情周期变化;体视镜观察卵巢组织形态;苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理学及卵泡计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织AMPK、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,次级、成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多,FSH、LH、AMPK mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),E2含量,mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,归肾丸组次级、成熟卵泡增多,闭锁卵泡减少,FSH、LH含量、AMPK mRNA表达及蛋白表达显著降低(P<0.01),E2含量、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA表达及蛋白表达显著升高(P<0.01)。与归肾丸组比较,四物汤组、右归饮组、左归饮组成熟卵泡数量显著减少,闭锁卵泡数量显著增多(P<0.01);四物汤组、右归饮组、左归饮组LH显著升高(P<0.01),FSH明显升高(P<0.05),E2明显降低(P<0.05);右归饮组AMPK蛋白表达明显升高(P<0.05),mTOR和HIF-1 mRNA表达显著降低(P<0.01),VEGF蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.01);四物汤组mTOR和HIF-1 mRNA,VEGF蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05);左归饮组mTOR mRNA和VEGF蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论:归肾丸可以抑制AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路来改善卵泡发育不良大鼠模型的卵巢功能、促进卵泡成熟,且总体疗效优于左归饮、右归饮和四物汤,表明该模型的证候更符合肾精亏虚证。

苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及作用机制

目的 探讨苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及其可能的作用机制。方法 将传代培养的Eca-109细胞分为对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组。对照组细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,低、中、高浓度苦参碱组细胞分别加入终质量浓度为1.0、1.5、2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞的活性,免疫荧光细胞化学染色法检测各组细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)的定位及表达,Western blot法检测各组细胞中多聚蛋白62(P62)、LC3蛋白的相对表达量,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量,透射电子显微镜观察对照组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞的超微结构。另取传代培养的Eca-109细胞,将细胞分为对照组、自噬抑制剂组、苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组。对照组细胞加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,自噬抑制剂组细胞加入终浓度为7μmol·L^(-1)的3-甲基腺嘌呤(3-MA)溶液,苦参碱组细胞加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液,自噬抑制剂+苦参碱组细胞先加入终浓度为7μmol·L^(-1) 3-MA溶液预孵育3 h,再加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)苦参碱溶液;培养24 h后,采用Western blot法检测各组细胞中Beclin1、LC3和肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 低、中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞质中均可见到红色荧光标记的LC3蛋白阳性表达。对照组细胞中LC3蛋白呈弥散状态;各浓度苦参碱组细胞中LC3蛋白呈斑点状态,且苦参碱浓度越高,细胞质中呈斑点状LC3蛋白越多。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于低浓度苦参碱组(P<0.05);中浓度苦参碱组与高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低浓度苦参碱组与对照组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于对照组和低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组细胞中可见正常的细胞质、细胞器和细胞核,高浓度苦参碱组细胞质中可见大量大小不等的自噬泡,并可见包裹有细胞内容物的自噬体。自噬抑制剂组与对照组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著高于对照组和自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著低于苦参碱组(P<0.05)。自噬抑制剂组Eca-109细胞中磷酸化LKB1(p-LKB1)/LKB1、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK显著低于对照组,磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR显著高于对照组(P<0.05);苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组,p-mTOR/mTOR显著低于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组与对照组Eca-109细胞中p-mTOR/mTOR比较差异无统计学意义(P>0.05)。苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于自噬抑制剂组,p-mTOR/mTOR显著低于自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著低于苦参碱组,p-mTOR/mTOR显著高于苦参碱组(P<0.05)。结论 苦参碱可能通过调节LKB1/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达诱导食管癌Eca-109细胞发生自噬。

冬凌草甲素调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对高糖诱导的心肌细胞自噬的影响

目的探讨冬凌草甲素调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样激酶(ULK)1通路对高糖诱导的心肌细胞自噬的影响。方法取对数生长期的H9c2细胞,将其分为:对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(35 mmol/L葡萄糖)、冬凌草甲素低剂量组(35 mmol/L葡萄糖+5μmol/L冬凌草甲素)、冬凌草甲素中剂量组(35mmol/L葡萄糖+10μmol/L冬凌草甲素)、冬凌草甲素高剂量组(35 mmol/L葡萄糖+20μmol/L冬凌草甲素)、冬凌草甲素高剂量+AMPK抑制剂(Compound C)组(35 mmol/L葡萄糖+5μmol/L Compound C),72 h后,收集各组细胞用于后续实验。CCK-8法检测细胞存活;流式细胞术检测细胞凋亡;DCFH-DA荧光探针法检测各组H9c2细胞内活性氧(ROS)水平;透射电镜观察H9c2细胞内自噬小体;免疫荧光检测细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链(LC)3表达;Western印迹检测H9c2细胞中Beclin1、p62、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1蛋白表达。结果与对照组比较,高糖组H9c2细胞存活率、自噬小体数量、LC3阳性率、Beclin1、p-AMPK蛋白表达降低,细胞凋亡率、ROS水平、p62、p-mTOR、p-ULK1蛋白表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,冬凌草甲素低、中、高剂量组H9c2细胞存活率、自噬小体数量、LC3阳性率、Beclin1、p-AMPK蛋白表达显著升高,细胞凋亡率、ROS水平、p62、p-mTOR、p-ULK1蛋白表达显著降低,且呈显著剂量依赖性(P<0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+Compound C组H9c2细胞存活率、自噬小体数量、LC3阳性率、Beclin1、p-AMPK蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、ROS水平、p62、p-mTOR、p-ULK1蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论冬凌草甲素可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进高糖诱导的H9c2细胞自噬。

促卵合剂调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路改善卵泡发育不良大鼠氧化应激及凋亡的作用机制

目的:探讨促卵合剂通过调控腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子(AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF)通路改善卵泡发育不良(FM)大鼠氧化应激及凋亡的作用机制。方法:将48只雌性SD大鼠随机分为正常组8只,造模组40只,造模组大鼠连续灌胃雷公藤多苷混悬液(75 mg·kg^(-1))30 d进行造模,造模后随机分为模型组、克罗米芬组(4.5 mg·kg^(-1))、促卵合剂低、中、高剂量组(8.1、16.2、32.4 g·kg^(-1)),每组8只。相应剂量药物给药,正常组及模型组灌胃等体积灭菌水,连续干预14 d。巴氏染色检测各组大鼠动情周期变化;苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理学及卵泡计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)含量;化学荧光法检测卵巢组织中活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡率;免疫组化法检测卵巢组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,次级、成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多,血清FSH及LH含量,卵巢组织ROS含量、Bax表达、卵巢颗粒细胞凋亡率、AMPK mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2表达、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,克罗米芬组及促卵合剂高、中剂量组次级卵泡和成熟卵泡增加,闭锁卵泡显著减少,血清FSH及LH含量、卵巢组织ROS含量、Bax表达、细胞凋亡、AMPK mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01)。结论:促卵合剂可能通过调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路来抑制氧化应激减少颗粒细胞凋亡,促进卵泡正常发育成熟,减少卵泡闭锁,保护卵巢功能,进而对FM发挥治疗作用。

益气活血养阴清热方对糖尿病肾病大鼠肾组织自噬信号通路AMPK/mTOR/ULK1的影响

目的:观察益气活血养阴清热方对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织损伤及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/UNC-51样激酶1(ULK1)(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路的影响,探讨其治疗DN的可能作用机制,为临床应用益气活血养阴清热方治疗DN提供客观的理论依据。方法:将90只SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组和造模组,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。6 w后造模组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DN模型,模型制备成功后随机分为模型对照组、益气活血养阴清热方7.7、15.3、30.6 g/kg组、厄贝沙坦0.017 g/kg组。给药后检测大鼠空腹血糖(FBG)、24 h尿蛋白(24 h-UTP)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量;HE染色、Masson染色、碘酸六胺银(PASM)染色观察肾组织病理变化;透射电镜观察肾组织超微结构变化;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin 1)表达水平;Western blot法检测大鼠肾组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1蛋白表达;Real-time PCR法检测大鼠肾组织Ampk、Mtor、Ulk1 mRNA表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠FBG、Scr、BUN、24 h-UTP含量显著升高(P<0.01),肾小球增大,基底膜增厚,系膜基质增生,毛细血管扩张明显,足突融合,LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),p-mTOR、mTOR蛋白表达显著上调(P<0.01);Ampk、Ulk1 mRNA表达显著下调(P<0.01),Mtor mRNA表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,益气活血养阴清热方30.6 g/kg组大鼠FBG、Scr、BUN、24 h-UTP含量显著降低(P<0.01);肾小球增大减轻,肾组织病理变化改善,同时可见明显的自噬溶酶体,LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表达显著升高(P<0.01);AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1表达显著上调(P<0.01),mTOR、p-mTOR表达显著下调(P<0.01);Ampk、Ulk1 mRNA表达显著上调(P<0.01),Mtor mRNA表达显著下调(P<0.01)。结论:益气活血养阴清热方能够缓解DN大鼠肾组织损伤,其机制可能与调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的肾组织自噬有关。

当归芍药散对MAFLD大鼠AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路的调节作用

目的:观察当归芍药散对代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)大鼠腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路的调控作用,探讨其对MAFLD大鼠的治疗作用及机制。方法:60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组(多烯磷脂酰胆碱胶囊,0.144 g·kg^(-1))及当归芍药散低、中、高剂量组(2.44、4.88、9.76 g·kg^(-1))。采用高脂饲料连续喂养8周后,各用药组给予相应药物治疗4周。给药结束后,收集血清和肝组织用于后续实验检测。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝组织TC、TG、游离脂肪酸(FFA)的含量或活性均显著升高(P<0.01),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著降低(P<0.01),肝组织磷酸化(p)-AMPK、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)Ⅱ、Beclin1和ULK1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),p-mTOR和泛素结合蛋白p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01),肝细胞出现脂肪性变,NAFLD活动度评分(NAS)和油红O染色面积均明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,当归芍药散可降低血清TC、TG、ALT、AST和肝组织TC、TG、FFA的含量或活性及p-mTOR和p62蛋白表达水平(P<0.01),升高血清HDL-C含量及肝组织p-AMPK、LCBⅡ、Beclin1和ULK1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),改善肝组织脂肪性变,降低NAS和油红O染色面积(P<0.05,P<0.01)。结论:当归芍药散对MAFLD大鼠有治疗作用,其机制可能与调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强自噬有关。

基于AMPK/mTOR/NLRP3信号通路探究复方黄柏液对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症的影响

目的基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)通路探究复方黄柏液(CCPF)对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症的影响。方法大鼠分为NC组、Model组、CCPF组(5 ml)、CCPF+compound C(AMPK抑制剂)组(5 ml CCPF+0.25 mg/kg compound C)、CCPF+MHY1485(m TOR激活剂)组(5 ml CCPF+10 mg/kg MHY1485),每组12只。除NC组外,其它组大鼠均需向右耳皮内注射痤疮丙酸杆菌混悬液以构建痤疮模型。建模成功后,进行给药处理,每天1次,持续14 d。观察各组大鼠耳部炎症、红肿情况;利用游标卡尺测量大鼠右耳耳廓的厚度,并计算耳廓肿胀率、耳廓痤疮数;HE染色检测耳廓组织病理变化并计数炎性细胞数;ELISA法检测大鼠血清中睾酮(T)、雌二醇(E2)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)水平;免疫组化检测大鼠耳组织中TNF-α、IL-8蛋白水平;Western blot检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)蛋白表达。结果与NC组比较,Model组大鼠耳廓组织红肿明显,注射部位有脓疱产生,血管充血及炎性细胞浸润明显,耳廓厚度、耳廓肿胀率、耳廓痤疮数、T、TNF-α、IL-8水平、p-mTOR/mTOR、NLRP3、caspase-1蛋白表达升高,E2、p-AMPK/AMPK水平降低(P<0.05);与Model组比较,CCPF组的上述指标均得到改善(P<0.05);compound C或MHY1485逆转了CCPF对痤疮丙酸杆菌诱导的大鼠皮肤炎症的改善作用。结论CCPF可能通过激活AMPK/mTOR通路来抑制NLRP3炎症小体的激活,从而改善痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症。

氟暴露对NG108-15细胞自噬及AMPK/mTOR/ULK1通路的影响

目的探讨氟暴露对小鼠神经母细胞瘤与大鼠神经胶质瘤融合细胞(NG108-15细胞)自噬及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Unc-51样激酶1(ULK1)表达的影响。方法体外培养NG108-15细胞,按照氟化钠终浓度分为对照组(0 mg/L)、低氟组(20 mg/L)、中氟组(40 mg/L)、高氟组(80 mg/L),处理24 h后收集细胞备用。采用免疫荧光(IF)/免疫细胞化学(ICC)法检测细胞自噬情况(以磷酸氯喹处理为自噬阳性对照);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表达水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、AMPK、mTOR、ULK1、磷酸化(p)-AMPK、p-mTOR、p-ULK1表达水平。结果对照组未检出自噬体,各染氟组均检出自噬体;且低、中、高氟组LC3B蛋白表达水平(1.80±0.59、2.16±0.60、2.30±0.57)均明显高于对照组(1.00±0.29,均P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与对照组比较,中、高氟组AMPK mRNA表达水平均较高(2.30±0.57、4.41±1.05比1.00±0.01,均P<0.05);低、中、高氟组mTOR mRNA表达水平均较低(0.79±0.04、0.76±0.09、0.64±0.10比1.00±0.01,均P<0.05),ULK1 mRNA表达水平均较高(1.81±0.39、1.96±0.35、4.22±1.03比1.00±0.01,均P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组比较,低、中、高氟组AMPK(1.21±0.05、1.20±0.04、1.30±0.07比1.00±0.03),p-AMPK(1.12±0.05、1.20±0.06、1.49±0.07比1.00±0.02),ULK1(1.16±0.05、1.26±0.05、1.15±0.05比1.00±0.04)及p-ULK1蛋白表达水平均较高(1.19±0.04、1.17±0.02,1.24±0.05比1.00±0.05,均P<0.05),mTOR蛋白表达水平均较低(0.77±0.03、0.60±0.03、0.55±0.04比1.00±0.04,均P<0.05);中、高氟组p-mTOR蛋白表达水平均较低(0.93±0.05、0.48±0.02比1.00±0.02,均P<0.05)。结论氟暴露可致NG108-15细胞发生自噬,AMPK、ULK1表达上调,而mTOR表达下调。

基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨解毒通络保肾方改善糖尿病肾脏疾病的作用机制

目的通过动物实验及细胞实验观察解毒通络保肾方对糖尿病肾脏疾病(DKD)大鼠肾脏病理形态及大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖的影响,探讨其改善DKD的作用机制。方法(1)从85只健康雄性SD大鼠中任取10只纳入正常组,其余大鼠采用高脂饲料喂养与链脲佐菌素注射诱导为DKD模型。造模成功的大鼠按体质量随机分为模型组,厄贝沙坦组(16 mg/kg),解毒通络保肾方低、中、高剂量组(0.5、1.0、2.0 g/kg)。正常组及模型组给予等量生理盐水灌胃。每日1次,连续灌胃8周。采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态,蛋白质印迹法检测肾脏组织自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin-1)、自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、泛素结合蛋白P62(P62)、自噬相关蛋白5(ATG5)的表达。(2)培养HBZY-1细胞,分为空白对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),模型组(30 mmol/L葡萄糖),解毒通络保肾方低、中、高剂量组(50、100、200 mg/L),厄贝沙坦组(5μmol/L)。采用CCK8法检测细胞增殖率,划痕实验检测细胞迁移能力,蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、ATG5与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、unc-51样激酶1(ULK1)及磷酸化蛋白(p-ULK1、p-AMPK及p-mTOR)的表达。结果(1)解毒通络保肾方可改善DKD大鼠肾脏基底膜、系膜、肾小管上皮细胞病理形态与超微结构,增加自噬小体、自噬溶酶体数量。与正常组比较,模型组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5蛋白表达降低,P62蛋白表达增加(P<0.01);解毒通络保肾方干预后,肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5蛋白表达增加,P62蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。(2)解毒通络保肾方可抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、p-ULK1、p-AMPK蛋白表达,降低P62、p-mTOR蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论解毒通络保肾方可改善DKD大鼠肾脏组织病理与超微结构,抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,其机制可能是通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路,改善细胞自噬实现的。

基于AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的自噬探讨芪黄益气摄血方治疗免疫性血小板减少症模型小鼠的作用机制

目的:基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路介导的自噬探讨芪黄益气摄血方治疗免疫性血小板减少症(ITP)模型小鼠的作用机制。方法:50只BALB/c小鼠随机分为5组,分别为正常组、模型组、芪黄益气摄血方高、低剂量组和强的松组,每组10只。采用豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)腹腔注射方法,建立ITP小鼠模型;注射APS后的第8天,各组分别灌胃给药,连续14 d。检测外周血血小板计数(PLT)和血红蛋白(Hb)浓度变化;分离脾脏、胸腺组织,称质量,计算脏器指数;取胸骨做骨髓涂片,显微镜下进行骨髓巨核细胞分类;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清血小板生成素(TPO)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、γ干扰素(IFN-γ)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测脾脏AMPK、mTOR、ULK1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1)、p62 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脾脏AMPK、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠外周血PLT计数、Hb及TPO水平明显下降(P<0.05,P<0.01),脾脏和胸腺指数显著升高(P<0.01),骨髓产板巨核细胞数显著减少(P<0.01),血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平显著升高(P<0.01),而IL-10、TGF-β1水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,芪黄益气摄血方高、低剂量组及强的松组显著增加模型小鼠PLT计数、TPO水平(P<0.01),明显降低脾脏和胸腺指数(P<0.05,P<0.01),明显增加骨髓产板巨核细胞数(P<0.05,P<0.01),明显降低血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平(P<0.05,P<0.01),明显提高IL-10、TGF-β1水平(P<0.05,P<0.01);与芪黄益气摄血方低剂量组比较,芪黄益气摄血方高剂量组和强的松组在改善PLT计数、细胞炎性因子水平方面呈现不同程度的显著性差异(P<0.05,P<0.01)。Real-time PCR和Western blot结果显示,与正常组比较,模型组小鼠脾脏AMPK、LC3、Beclin1 mRNA和p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达均明显上调(P<0.05,P<0.01),mTOR、ULK1、p62 mRNA和p-mTOR、p-ULK1、p62蛋白表达水平明显下调(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,芪黄益气摄血方高、低剂量组及强的松组可明显下调脾脏AMPK、LC3、Beclin1 mRNA和p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时明显上调mTOR、ULK1、p62 mRNA和p-mTOR、p-ULK1、p62蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:芪黄益气摄血方可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬的过度发生,从而调节免疫失耐受,发挥治疗ITP作用。

益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响

目的:通过观察益肾通络方对膜性肾病大鼠自噬相关蛋白的影响,探讨其对膜性肾病大鼠肾脏保护作用的可能分子机制。方法:80只SD大鼠随机抽取20只设为正常组,其余大鼠均采用预免疫和尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法制作膜性肾病大鼠模型。将模型复制成功的SD大鼠随机分为模型组,盐酸贝那普利组(10 mg·kg-1)及益肾通络方低、中、高剂量组(6.61,13.22,26.44 g·kg-1),给予相应剂量的药物灌胃,每天1次,连续灌胃4周。灌胃结束后,检测大鼠血浆白蛋白(ALB),甘油三酯(TG),胆固醇(TC),血肌酐(SCr),尿素氮(BUN),24 h尿蛋白(UTP)定量指标的变化;苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色、碘酸六胺银(PASM)染色及透射电镜下观测肾脏病理形态改变;免疫荧光法检测肾小球中免疫球蛋白(Ig)G和补体C3的沉积;免疫组化(IHC)法观察自噬标志蛋白Beclin-1,微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ),p62蛋白的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测腺苷酸活化蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路相关蛋白的表达情况。结果:与正常组比较,模型组大鼠UTP水平显著升高(P<0.01),血清中TG,TC水平显著升高(P<0.01),ALB水平显著下降(P<0.01);肾小球结构紊乱,体积增大,基底膜可见不同程度增厚和部分肾小管空泡样变性,大量胶原纤维和嗜复红蛋白沉积,足细胞足突广泛融合,肾小球毛细血管襻IgG和补体C3弥漫性沉积;自噬标志蛋白Beclin-1,LC3Ⅱ表达显著降低(P<0.01),p62蛋白表达显著升高(P<0.01);磷酸化-腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表达显著降低(P<0.01),磷酸化-雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR),磷酸化-Unc-51样激酶1(p-ULK1)蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,益肾通络方各剂量组、盐酸贝那普利组大鼠TG,TC,UTP水平均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01),ALB水平显著升高(P<0.01),血清SCr,BUN水平均差异无统计学意义;肾脏病理损害不同程度减轻;自噬标志蛋白Beclin-1,LC3Ⅱ表达水平不同程度升高(P<0.05,P<0.01),p62蛋白表达不同程度降低(P<0.05,P<0.01);p-AMPK蛋白表达水平不同程度升高(P<0.05,P<0.01),p-mTOR,p-ULK1蛋白表达水平不同程度降低(P<0.05,P<0.01)。结论:益肾通络方对膜性肾病大鼠具有肾脏保护作用,其机制可能与调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达,激活自噬有关。

基于AMPK/mTOR/ULK1自噬相关通路探讨左归降糖通脉方对AGEs合并缺糖缺氧星形胶质细胞炎性损伤的影响

目的:探讨左归降糖通脉方对糖基化终末产物(AGEs)合并缺糖缺氧(OGD)损伤后星形胶质细胞(AS)的影响及干预机制。方法:使用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8)确定AGEs作用浓度及OGD时间,选择左归降糖通脉方(ZGJTTMP)含药血浆的作用浓度;将星形胶质细胞随机分为空白组、模型(AGEs+OGD)组、ZGJTTMP组、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂(Compound C)组、AMPK激动剂(AICAR)组、ZGJTTMP+AICAR组,倒置显微镜下观察各组细胞形态结构,CCK-8法检测各组细胞存活率,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白细胞介素^(-1)β(IL^(-1)β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;电镜下观察各组细胞内自噬小体的数目,免疫荧光染色法观察各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞LC3、p62、磷酸化(p)-AMPK、AMPK、磷酸化(p)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、mTOR、磷酸化(p)-UNC-51样激酶1(ULK1)、ULK1蛋白的表达情况。结果:选择AGEs 200 mg·L^(-1)合并OGD 6 h作为最适造模条件,5%作为ZGJTTMP含药血浆的最佳作用体积分数。倒置显微镜下见造模后细胞受损严重,ZGJTTMP组与Compound C组细胞损伤得到明显改善;ELISA结果示模型组IL^(-1)β、IL-6、TNF-α的含量显著增加(P<0.01),ZGJTTMP组与Compound C组炎症因子含量显著下降(P<0.01);电镜下可见模型组细胞内自噬小体数目明显增多,免疫荧光结果示LC3荧光表达面积显著增加(P<0.01),ZGJTTMP组与Compound C组细胞内自噬小体数目明显减少,LC3表达面积显著减少(P<0.01);Western blot结果显示,与空白组比较,模型组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著升高(P<0.01),p62、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1显著下降(P<0.01),与模型组比较,ZGJTTMP组与Compound C组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著下降(P<0.01),p62、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1显著升高(P<0.01)。结论:ZGJTTMP对AGEs合并OGD炎性损伤的星形胶质细胞具有保护作用,这一作用是通过抑制了AMPK/mTOR/ULK1自噬相关通路的激活,从而抑制了自噬的过度表达实现的。

二甲双胍抗衰老作用的研究进展

二甲双胍临床上用于治疗2型糖尿病,近年来研究发现除了治疗糖尿病等作用外,二甲双胍尚能延长动物和人类寿命。其作用机制可能是通过活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR),降低胰岛素水平和胰岛素样生长因子受体信号通路,降低活性氧(ROS)产生和调节长寿蛋白(SIRTs)发挥作用。

利拉鲁肽对高糖诱导的H9c2心肌细胞焦亡的保护作用

目的研究利拉鲁肽(LRG)对高糖诱导的H9c2心肌细胞焦亡的保护作用和机制。方法分别用不同剂量的LRG和高糖处理细胞48 h,挑选出LRG最佳干预剂量。将H9c2细胞分为6组:对照组、高糖组和低、中、高剂量LRG(LRG-L、LRG-M、LRG-H)组、LRG-H+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞存活率;用流式细胞术检测细胞焦亡情况;用酶联免疫吸附(ELISA)法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)水平;用实时荧光定量聚合酶链反应法检测Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症体相关基因表达;用蛋白质印迹法检测NLRP3炎症体、自噬、沉默信息调节因子1/腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Sirt1/AMPK/mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果对照组、高糖组、LRG-L组、LRG-M组、LRG-H组、LRG-H+3-MA组细胞焦亡率分别为(1.62±0.74)%、(15.30±0.98)%、(12.68±0.66)%、(9.70±0.67)%、(7.24±0.83)%、(13.66±0.70)%;IL-1β水平分别为(22.33±4.76)、(74.51±5.56)、(61.33±6.00)、(48.94±4.20)、(37.62±4.03)、(64.10±6.07)ng·L^(-1);NLRP3蛋白表达量分别为1.01±0.11、6.44±0.48、5.31±0.21、4.16±0.20、3.18±0.46、5.26±0.43;Beclin-1蛋白表达量分别为1.01±0.11、0.25±0.04、0.44±0.03、0.63±0.03、0.84±0.08、0.40±0.07。上述指标,高糖组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);LRG-L组、LRG-M组、LRG-H组与高糖组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);LRG-H+3-MA组和LRG-H组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。LRG各剂量组Sirt1、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著升高,p-mTOR/mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论LRG通过调控Sirt1/AMPK/mTOR信号通路增强细胞自噬,抑制NLRP3炎症体活化,从而减轻高糖诱导的心肌细胞焦亡。