丝裂原活化蛋白激酶通路在GSK-3β对于巨噬细胞活化过程中的作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在GSK-3β对于巨噬细胞活化过程中可能的作用。方法生长状态良好的RAW264.7细胞分为3组:对照组、脂多糖(LPS)组及GSK-3抑制剂SB216763干预组。在两个时间点(12 h、24 h),采用Western blotting法检测GSK-3β、p-GSK-3βser9、MAPK(c-jun氨基端激酶、细胞外信号调节激酶、p-38)表达情况,Elisa法检测细胞上清中TNF-α的变化,RT-PCR检测细胞中5-LO mRNA变化,电镜下观察RAW264.7细胞形态变化。结果 LPS组与对照组比较,p-GSK-3βser9/GSK-3β比值降低,活性升高;MAPK 3条信号通路:磷酸化的c-jun氨基端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、p38表达增多;TNF-α和5-LO mRNA表达增多(P<0.05);电镜下观察RAW264.7细胞出现形态改变,可见大量坏死物质。SB216763组与LPS组比较,p-GSK-3βser9/GSK-3β比值升高,活性降低;磷酸化JNK、ERK、p38表达出现不同时间不同程度改变;TNF-α和5-LO mRNA表达降低(P<0.05);电镜下观察RAW264.7细胞形态较规则,仅见少量坏死物质。结论 MAPK通路在GSK-3β对于RAW264.7细胞活化过程中发挥一定的作用。

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶2在肝细胞癌中过表达并介导肝癌细胞中糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白信号传导

目的探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK2)在肝癌组织与正常肝脏组织中的表达差异以及介导肝细胞癌(HCC)细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号传导的相关机制。方法收集配对的HCC及正常组织20对,采用实时荧光定量PCR技术检测SGK2 mRNA表达情况。应用蛋白质印迹法检测人肝癌细胞系Huh-7、SMMC-7721以及正常人肝细胞系L02中SGK2蛋白水平。应用SGK2 siRNA转染人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-7,然后使用蛋白质印迹方法检测上述转染成功细胞系中GSK-3β、β-catenin的蛋白质表达水平。计量资料以均值±标准差(±s)表示,统计学方法采用Student t检验。结果与配对正常肝组织中的表达水平相比,所有20个HCC样品中SGK2 mRNA表达上调。在两种人肝癌细胞系(Huh-7和SMMC-7721)中SGK2蛋白水平显著高于正常人肝细胞系(P<0.01)。在人HCC细胞系SMMC-7721和Huh-7中,SGK2表达下调抑制了未磷酸化GSK-3β表达。另外,在HCC细胞系中SGK2表达下调通过阻止β-catenin蛋白酶体降解来降低β-catenin的去磷酸化。结论SGK2在HCC中过表达并介导HCC细胞中GSK-3β/β-catenin信号传导。

葛根素通过调控AMPK/GSK-3β/β-catenin信号通路缓解糖尿病大鼠心肌损伤

目的:观察葛根素对糖尿病大鼠心肌损伤的影响,并探讨葛根素对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)通路的调控作用。方法:雄性SD大鼠分为正常对照组、模型组、葛根素低剂量(20 mg/kg)组、葛根素高剂量(40 mg/kg)组、葛根素高剂量+Compound C(AMPK抑制剂,1 mg/kg)组,每组15只,除正常对照组外其余各组大鼠均采用1%链脲佐菌素构造糖尿病模型,测定大鼠左心室LVESD、LVEDD、EF、FS;检测大鼠FBG、FINS、HbA1c水平,并计算HOMA-IR;检测大鼠血清CK-MB、cTnⅠ水平;对大鼠心肌组织进行HE染色及Masson染色观察大鼠心肌病理学变化;TUNEL法观察大鼠心肌细胞凋亡;Western Blot法检测大鼠AMPK/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠心肌细胞形态不规则、排列紊乱、局部肌纤维横纹消失,可见心肌细胞水肿,纤维增生明显,少量心肌细胞变性、坏死,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著升高,EF、FS及心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平和核β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,葛根素各剂量组大鼠心肌损伤现象好转,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著降低,EF、FS及心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平和核β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.05)。与葛根素高剂量组比较,葛根素高剂量+Compound C组大鼠心肌损伤加重,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著升高,EF、FS和心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平及核β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:葛根素可通过激活AMPK/GSK-3β/β-catenin信号通路改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗与心肌损伤。

姜黄素对子宫内膜异位症大鼠PI3K/AKT/GSK-3β通路及肥大细胞活化的影响

目的:观察姜黄素对子宫内膜异位症(EM)大鼠的影响,并初步探讨其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、姜黄素低、中、高剂量组和阳性对照组,除假手术组外均通过外科手术将右侧自体子宫组织移植到大鼠左侧腹部腹壁,缝合腹部建立EM模型,假手术组仅分离右侧子宫内膜,不进行自体移植。假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃;姜黄素低、中、高剂量组分别给予60、120、240 mg/kg姜黄素灌胃;阳性对照组给予125 mg/kg孕三烯酮灌胃,1次/d,连续灌胃21 d,解剖后观察各组大鼠内异部位内异灶和盆腔黏连情况;HE染色观察各组大鼠内移灶组织病理学变化;甲苯胺蓝染色观察各组大鼠内异灶组织中肥大细胞总数量及脱落颗粒肥大细胞数量;采用TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒检测各炎症因子水平;Western blot检测各组大鼠内异灶组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表达。结果:假手术组大鼠子宫内膜完整,上皮细胞柱状排列整齐,腺体自然;模型组大鼠异位内膜组织生长状态良好,腺体上皮细胞和基质细胞均正常;姜黄素低、中、高剂量组大鼠异位子宫内膜上皮细胞形状逐渐变为单层柱状,腺体和基质细胞数量逐渐减少,并出现空化现象;阳性对照组上述现象介于姜黄素中剂量组和高剂量组之间。与假手术组相比,模型组子宫内膜异位症大鼠内异灶面积、盆腔黏连评分、内异灶组织肥大细胞总数、脱颗粒肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞/肥大细胞总数、TNF-α、IL-1β和IL-6水平、PI3K、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,姜黄素低、中、高剂量组子宫内膜异位症大鼠内异灶面积和盆腔黏连评分、异位灶组织脱颗粒肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞/肥大细胞总数、TNF-α、IL-1β和IL-6水平、PI3K、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达均降低(P<0.05),阳性对照组大鼠上述指标均显著降低(P<0.05)。结论:姜黄素可阻抑EM大鼠内异灶组织生长,可能与抑制PI3K/AKT/GSK3β通路、降低肥大细胞活化及炎症反应相关。

异鼠李素激活PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信号通路减轻鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤

目的探讨异鼠李素(isorhamnetin,ISO)是否能够通过激活PI3K/Akt/GSK-3β/CREB通路减轻鱼藤酮对PC12细胞的损伤作用。方法采用MTT法检测细胞活力,LDH检测乳酸脱氢酶释放,Western blot法测定p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、p-CREB和CREB蛋白表达。结果与对照组相比,鱼藤酮损伤后PC12细胞活力明显降低,CREB的磷酸化程度显著降低。异鼠李素预处理组细胞存活率和磷酸化CREB的表达均高于鱼藤酮损伤模型组。此外,异鼠李素预处理增强了鱼藤酮损伤后PC12细胞中Akt和GSK-3β的磷酸化程度。加入PI3K抑制剂LY294002可以抑制Akt、GSK-3β和CREB的磷酸化水平,从而部分消除异鼠李素对鱼藤酮损伤PC12细胞的神经保护作用。结论异鼠李素可能通过PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信号通路发挥PC12细胞保护作用。

激肽释放酶-激肽系统的细胞内作用机制研究进展

激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS)主要包括激肽释放酶、激肽原和激肽,激肽原在激肽释放酶的作用下转化为激肽和缓激肽,后者作用于缓激肽受体1(bradykinin 1 receptor,B1R)和/或受体2(B2R)或蛋白酶活化受体(protease activated receptors,PARs),调节细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、Janus激酶(Janus kinases,JAKs)/转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STATs)及线粒体内等多条信号通路而发挥生物学效应。文中旨在综述KKS调节细胞内信号通路的作用及其研究进展,以全面了解其作用机制。

复方安神定志灵方对ADHD模型大鼠Akt、GSK-3β、β-catenin蛋白及mRNA的影响

目的:探讨安神定志灵方对自发性高血压大鼠(SHR)前额叶、纹状体及海马中Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响。方法:将50只SHR大鼠随机分为模型组、利他林组(2mg/kg)、安神定志灵低、中、高剂量组(6.7、13.4、26.7g/kg),每组10只,另将10只Wistar京都大鼠设为正常组。每日灌胃2次,治疗4周后取大鼠脑组织。分别用蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫组织化学法及实时定量荧光PCR检测各组大鼠前额叶、纹状体、海马组织中Akt、GSK-3β和β-catenin的表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠前额叶、纹状体中β-catenin、Akt的蛋白及mRNA表达降低,GSK-3β相关表达增加;海马区β-catenin、Akt的OD值显著性降低(P<0.05),GSK-3β的OD值显著性升高(P<0.05)。治疗后与模型组比较,利他林及安神定志灵组能够增加大鼠前额叶、纹状体中β-catenin、Akt的蛋白及mRNA表达,降低GSK-3β的相关表达;增加大鼠海马区β-catenin、Akt的OD值,降低GSK-3β的OD值。结论:安神定志灵可以影响Akt、GSK-3β、β-catenin表达水平,其药效可能与抑制细胞凋亡、保护神经元存在关联。

人参皂苷Rh_2(S)抑制HDAC6促白血病细胞凋亡作用研究

目的研究人参皂苷Rh2(S)促白血病K562和KG1a细胞凋亡的机制。方法 CCK-8法检测人参皂苷Rh2(S)对细胞增殖的影响;镜下观察细胞的生长情况;流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡;Western blotting法检测周期和凋亡相关蛋白以及组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、热休克蛋白90(HSP90)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达。结果 CCK-8结果显示人参皂苷Rh2(S)对K562和KG1a细胞具有较明显的增殖抑制作用;FCM结果显示人参皂苷Rh2(S)能够将K562和KG1a细胞周期阻滞在G0/G1期,同时促进细胞凋亡;Westernblotting结果显示人参皂苷Rh2(S)能够抑制Bcl-2、Cyclin D1、HDAC6、HSP90、p-Akt和β-catenin蛋白的表达,促进Bax、Ac-α-tubulin和GSK-3β蛋白的表达。结论 Rh2(S)通过抑制HDAC6的表达导致HSP90的表达下降,进一步抑制Akt的活性,激活GSK-3β,最后抑制Wnt/β-catenin信号通路,促进白血病细胞凋亡。

基于网络药理学的脑震宁颗粒治疗脑外伤的机制分析

目的借助网络药理学技术预测脑震宁颗粒主要成分的潜在作用靶点,探讨其治疗脑外伤多成分-多靶点-多通路的作用机制。方法依据反向分子对接服务器(DRAR-CPI)和Coo LGe N数据库预测和筛选脑震宁颗粒主要成分的作用靶点;采用Cytoscape软件Clue GO插件对靶点进行GO富集分析,借助生物信息学注释数据库(DAVID)对获取的靶点信息进行KEGG通路注释分析;采用Cytoscape软件构建药材-成分-靶点-通路-疾病网络。结果脑震宁颗粒的33个主要成分涉及丝裂原活化蛋白激酶-1(MAPK1)、胱天蛋白酶-3(CASP3)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)等34个靶点,GO富集分析和KEGG通路注释分析提示脑震宁颗粒可作用于活性氧的生物合成、平滑肌细胞增殖等生物过程,以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK通路、JAK/STAT、m TOR等信号转导通路;网络分析显示脑震宁颗粒的作用机制可能与调控氧化应激、抑制炎症反应和神经细胞凋亡、调节脑内硫化氢生成和纤溶酶原(PLG)活性、改善认知功能及脑外伤后抑郁等相关。结论揭示了脑震宁颗粒多成分、多靶点、多通路的作用机制,为进一步深入研究脑震宁颗粒药效物质基础及作用机制奠定了基础。