长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因2/微小RNA-30c-5p/丝裂原活化蛋白激酶1轴在食管癌细胞紫杉醇耐药中的作用机制实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因2(DLEU2)/微小RNA(miR)-30c-5p/丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)轴在食管癌细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用机制。方法:构建EC109/PTX细胞,检测食管癌组织和癌旁正常组织,以及食管癌细胞EC109和KYSE150细胞、食管上皮细胞SHEE和EC109/PTX细胞DLEU2、miR-30c-5p、MAPK1 mRNA表达。取生长良好的EC109/PTX细胞,分为沉默(siRNA)DLEU2组、阴性对照(siRNA NC)组、siRNA DLEU2+miR-30c-5p抑制剂(inhibitor)组、siRNA DLEU2+inhibitor NC组、siRNA DLEU2+过表达(pcDNA)MAPK1组、siRNA DLEU2+pcDNA NC组和空白组。验证miR-30c-5p与DLEU2、MAPK1的靶向关系。检测各组EC109/PTX细胞DLEU2、miR-30c-5p、MAPK1 mRNA表达水平。检测EC109/PTX细胞活性、凋亡情况及对PTX的耐药性。检测谷胱甘肽S-转移酶π(GST-π)、MAPK1、P-蛋白(P-gp)蛋白表达水平。结果:食管癌组织和EC109/PTX细胞miR-30c-5p表达降低,DLEU2、MAPK1 mRNA表达增加(均P<0.05)。DLEU2靶向调控miR-30c-5p,miR-30c-5p靶向调控MAPK1。siRNA DLEU2组miR-30c-5p表达和细胞凋亡率较siRNA NC组、空白组增加,DLEU2和MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、药物半数抑制浓度(IC 50)以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达降低(均P<0.05)。siRNA DLEU2+miR-30c-5p inhibitor组miR-30c-5p表达和细胞凋亡率较siRNA DLEU2+inhibitor NC组降低,MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、IC 50以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达增加(均P<0.05)。siRNA DLEU2+pcDNA MAPK1组细胞凋亡率较siRNA DLEU2+pcDNA NC组降低,MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、IC 50以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达增加(均P<0.05)。结论:干扰lncRNA DLEU2可减弱EC109/PTX细胞对PTX的耐药性,可能与调控miR-30c-5p/MAPK1轴有关。

微小RNA-135b靶向结合叉头蛋白N3激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路促进神经母细胞瘤增殖的研究

目的探究微小RNA-135b(miR-135b)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响及其分子机制.方法用简单随机法将SH-SY5Y细胞分为miR-135b模拟物(mimics)组和miR-135b抑制物(inhibitor)组,以及阴性对照NC mimics组和NC inhibitor组并转染,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测各组细胞转染效果,细胞划痕实验、细胞活力检测(CCK-8)、细胞侵袭实验(Transwell™)检测细胞迁移、增殖和侵袭的生物学功能.生物信息学软件预测miR-135b的下游靶基因,双荧光素酶报告实验加以验证.免疫印迹法(Western blot)检测各组叉头蛋白N3(FOXN3)和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相关蛋白的表达情况.组间比较用t检验,多组比较用单因素方差分析.结果miR-135b mimics组的细胞迁移、增殖和侵袭能力高于NC mimics组[(28.47±1.10)%比(15.04±1.38)%,t=10.70,P<0.01;1.97±0.11比1.47±0.10,t=5.79,P<0.05;265.00±21.93比204.56±29.54,t=2.85,P<0.05];miR-135b inhibitor组的细胞迁移、增殖和侵袭能力低于NC inhibitor组[(7.67±1.24)%比(14.06±2.92)%,t=2.80,P<0.05;1.04±0.08比1.49±0.12,t=5.39,P<0.05;75.89±3.00比201.11±19.78,t=10.84,P<0.01].生物信息学软件预测发现FOXN3是miR-135b的靶基因之一,双荧光素酶报告基因实验证实.Western blot示miR-135b mimics组的FOXN3表达低于NC mimics组(0.35±0.15比0.82±0.07,t=4.96,P<0.01),PI3K、p-Akt/Akt表达高于NC mimics组(1.50±0.18比0.85±0.05,t=5.31,P<0.01;1.19±0.08比0.89±0.02,t=5.53,P<0.01);miR-135b inhibitor组的FOXN3表达高于NC inhibitor组(1.97±0.09比0.75±0.10,t=2.78,P<0.05),PI3K、p-Akt/Akt表达低于NC inhibitor组(0.77±0.11比1.03±0.07,t=4.58,P<0.05;0.64±0.01比0.82±0.07,t=4.43,P<0.05).结论miR-135b可能通过靶向结合FOXN3激活PI3K/Akt信号通路促进人神经母细胞瘤细胞增殖.

微小核糖核酸-1256抑制后的钙结合蛋白39上调激活腺苷酸活化蛋白激酶信号传导保护人成骨细胞免受地塞米松诱导的氧化损伤

目的:探索微小核糖核酸-1256(miR-1256)对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号传导和地塞米松(Dex)诱导的成骨细胞损伤的潜在影响。方法:分别培养hFOB1.19成骨细胞和原代人成骨细胞,地塞米松(1μmol/L,48 h)干预两种细胞,使用miR-1256前体的慢病毒(lv-premiR-1256)、miR-1256反义慢病毒(lv-antagomiR-1256)转染两种细胞。实时荧光定量PCR(qPCR)法检测miR-1256和钙结合蛋白39(CAB39)的mRNA表达水平,Western blot法检测miR-1256和CAB39蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞活力,台盼蓝染色法检测细胞死亡及细胞凋亡,RNA下拉检测miR-1256和CAB39的结合,Promega试剂盒检测CAB39的3’非翻译区(3’-UTR)荧光素酶报告基因活性,全自动荧光化学发光分析仪进行活性氧检测。统计学分析采用单因素方差分析。结果:miR-1256主要位于细胞质中,直接与CAB39的mRNA结合。在hFOB1.19细胞和原代人成骨细胞中,异位miR-1256过表达后,CAB39 3’-UTR荧光素酶报告基因活性及其表达下调;miR-1256抑制后,CAB39 3’-UTR荧光素酶报告基因活性及其表达升高。miR-1256的过表达降低了AMPKα1-乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化和AMPK的活性,但抑制miR-1256后上述活性增强。抑制miR-1256可增加NADPH活性和Nrf2级联基因的mRNA表达,从而抑制Dex诱导的hFOB1.19细胞和人成骨细胞的氧化损伤和细胞毒性。结论:miR-1256抑制后的CAB39上调激活了AMPK信号传导,从而保护人成骨细胞免受Dex诱导的氧化损伤。

长链非编码RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p调控信号通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)通过调控微小RNA-1-3p(miR-1-3p)的表达对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养正常胰腺细胞系hTERT-HPNE与胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3,将胰腺癌PaTu8988细胞按照随机数字表法分为si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG siRNA)、si-con组(转染siRNA Control)、miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、miR-con组(转染miR-1-3p阴性对照)、si-MIR4435-2HG+an⁃ti-miR-1-3p组(共转染MIR4435-2HG siRNA与miR-1-3p抑制剂)、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con组(共转染MIR4435-2HG siR⁃NA与miR-1-3p抑制剂的阴性对照),同时将未经任何处理的细胞作为NC组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测细胞中MIR4435-2HG与miR-1-3p的表达;双荧光素酶报告基因检测MIR4435-2HG与miR-1-3p的相互作用。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析敲低MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白的表达。结果MIR4435-2HG在胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常胰腺细胞;MIR4435-2HG可特异性结合miR-1-3p并调控其表达活性;敲低MIR4435-2HG与上调miR-1-3p表达后,可抑制胰腺癌PaTu8988细胞增殖,明显减弱细胞迁移及侵袭能力[其中NC组、miR-con组、si-MIR4435-2HG组增殖活性分别为48 h:(1.21±0.10)、(1.18±0.12)、(0.86±0.09),细胞迁移数量分别为(90.56±9.16)、(88.56±8.91)、(26.49±2.10),细胞侵袭数量分别为(160.79±16.12)、(155.09±15.49)、(69.23±7.10),均P<0.05],下调PaTu8988细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的表达;抑制miR-1-3p表达可促进胰腺癌PaTu8988细胞增殖、迁移及侵袭。结论敲低LncRNA MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-1-3p表达并抑制PI3K/Akt信号通路活化而降低细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达,进而减弱胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

黄连解毒汤对炎症损伤内皮细胞腺苷酸活化蛋白激酶及细胞间黏附分子-1的影响

目的研究黄连解毒汤对脂多糖(LPS)所致炎症损伤内皮细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响。方法培养人脐带静脉内皮细胞,鉴定后加入LPS诱发炎症损伤,将损伤后的内皮细胞分为空白组、对照组(5-氨基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷酸干预组)和观察组(黄连解毒汤干预组),用Western blot法检测各组AMPK水平及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)的表达,流式细胞仪检测各组ICAM-1表达,噻唑蓝法检测各组细胞的存活情况。结果各实验组间内皮细胞AMPK水平比较差异无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,观察组和对照组P-AMPK的表达量显著增高(P<0.05);ICAM-1表达量显著降低(P<0.05),且内皮细胞存活量显著增加(P<0.05)。结论黄连解毒汤可能通过影响AMPK、ICAM-1对炎症损伤内皮细胞起保护作用。

Compound C抑制腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化后对缺氧预处理的影响及其机制

【目的】探讨Compound C抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化后对缺氧预处理的影响。【方法】筛选合适的Compound C浓度。将细胞分为Compound C组和non-Compound C组,以上两组再各自分为3个亚组:对照组(control);缺氧预处理+缺氧组(Hyp+OGD);单纯缺氧组(OGD);噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性。ATP荧光检测试剂盒测定胞内的ATP水平。Western Blot法测定各组细胞内AMPKα,磷酸化的AMPKα(P-AMPKα),过氧化物酶体增生激活受体-γ共刺激因子-1α(PGC-1α)的蛋白表达水平。【结果】OGD后Compound C组(0.418±0.021)和non-Compound C组(0.640±0.028)相比,细胞活性下降更明显(P<0.01),经预处理后细胞活性均增加(P均<0.05),加入Compound C后,control组细胞活性下降3.5%(P=0.473),OGD组细胞活性下降34.6%(P<0.01),而缺氧预处理后细胞活性下降21.1%(P<0.05)。OGD后Compound C组(0.042±0.001)和non-Compound C组(0.051±0.001)相比,ATP下降更明显(P<0.05),经预处理后ATP水平分别增加了21.5%及28.0%(P均<0.05)。Compound C 3组AMPKα蛋白的表达与non-Compound C对应的3组相比差异无统计学意义(P均>0.05)。OGD后,Compound C组与non-Compound C组细胞P-AMPKα蛋白的表达均明显增加(与各自的对照组比较,P均<0.05)。经预处理后,non-Compound C组P-AMPKα蛋白的表达较单纯OGD组增加(P<0.05),但Compound C组P-AMPKα蛋白的表达与单纯OGD组间的差异无统计学意义(P=0.935)。Compound C组细胞PGC-1α蛋白的表达与non-Compound C组对应的3组比较明显下降(P均<0.05),其中control组下降了68.1%,Hyp+OGD组下降了24.7%,OGD组下降了39.6%,Hyp+OGD及OGD相对于各自control组均上调其表达(P均<0.05),且预处理组的上调更明显(与OGD组比较,P均<0.05)。【结论】Compound C抑制AMPK的激活后,PGC-1α的表达下调,AMPK为缺氧预处理或缺氧处理上调PGC-1α的其中一条途径,抑制其活体P-AMPKα后其他的途径仍然在缺氧预处理中发挥重要的细胞保护作用。

异丙基肾上腺素不同给药模式对小鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶活性的影响

目的:探讨β-肾上腺素受体(β-AR)激动剂异丙基肾上腺素(ISO)2种给药模式对小鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的影响,以及AMPK激动剂在这2种模式中对心脏结构和功能的不同作用。方法:采用皮下植入微渗透压泵的方法给予雄性BALB/c小鼠持续14 d输注ISO(5 mg·kg^(-1)·d^(-1))以及每日皮下注射AMPK激动剂AICAR(250 mg·kg^(-1)·d^(-1))。分别于植入泵14 d后和植入泵14 d并撤泵3 d后,利用超声心动图和血流动力学方法检测心脏功能并收集心脏样本。Western blot检测AMPK的磷酸化水平。结果:持续输注ISO14 d后心脏AMPK的磷酸化水平较对照组明显增加(P<0.05),AICAR并不进一步增加AMPK磷酸化水平,反而有减少ISO引起的心脏AMPK磷酸化水平增加的趋势。AICAR明显抑制ISO引起的心脏重量增加。反映心脏收缩功能的左室短轴缩短率(FS)和左心室压力最大上升速率(+dp/dt_(max))在ISO组显著高于对照组(P<0.05),AICAR并不进一步增加心脏收缩功能。反映心脏舒张功能的左室舒张末压(LVEDP)在各组并无明显改变。持续输注异丙基肾上腺素14 d并撤泵3 d后心脏AMPK的磷酸化水平与对照组的差异无统计学显著性。AICAR明显抑制ISO引起的心脏重量增加。+dp/dt_(max)在ISO组明显低于对照组(P<0.05),提示收缩功能下降。AICAR+ISO组与ISO组相比,有增加+dp/dt_(max)的趋势。反映心脏舒张功能的LVEDP在ISO组明显升高(P<0.05),提示舒张功能明显降低。而AICAR则显著改善了ISO引起的舒张功能异常(P<0.05)。给予ISO后,AMPK磷酸化水平增加和心率增加的时间曲线一致,均为5 min开始升高,30 min开始下降至基础水平。结论:β-AR持续激动使AMPK活性持续升高,而撤泵后AMPK活性则降至对照水平。观察AMPK激动对心脏功能的改善作用需避免β-AR激动引起的正性变时变力效应的干扰。

微小染色体维持蛋白7和活化蛋白激酶C受体在非小细胞肺癌中的表达及意义

非小细胞肺癌发生发展过程中多种基因和蛋白异常表达,使肿瘤的侵袭性增加。微小染色体维持蛋白7(MCM7)属于MCM蛋白家族,是启动DNA复制起始点的复制准许因子之一,参与DNA的合成,促进细胞的增殖〔1〕。活化蛋白激酶C受体-1(RACK1)属于天冬氨酸/色氨酸-40结构域蛋白家族成员,能与多种重要的细胞内蛋白质和信号分子形成协同作用,调节信号转导、周期演进、细胞生长和运动等功能〔2〕。本文关注MCM7和RACK1在非小细胞肺癌中的作用及二者的关系。

腺苷酸活化蛋白激酶在缺氧预处理中的保护作用及机制

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)参与缺氧预处理的保护作用及机制。方法将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分为空白对照组(Control)、单纯缺氧预处理组(Hyp)、缺氧预处理+缺氧组(Hyp+OGD)、单纯缺氧组(OGD)。通过噻唑蓝(MTT)细胞活力测定及DAPI核染色法判定细胞的损伤程度;Western Blot测定细胞内腺苷酸活化蛋白激酶α亚基(AMPKα)、磷酸化的AMPKα(P-AMPKα)及过氧化物酶体增生激活受体的共刺激因子-1α(PGC-1α)的蛋白表达水平。结果 4组间细胞活性有统计学差异(F=127,P<0.01),OGD组细胞活性减少至48%(与Control组相比,P<0.01),而Hyp+OGD组细胞的活力回升至62.5%(与OGD组相比,P<0.01)。4组细胞间三磷酸腺苷(ATP)含量有统计学差异(F=584.833,P<0.01),Hyp+OGD组ATP含量为0.114507±0.001837,较OGD组增加0.048266(P<0.01)。Hyp+OGD组和OGD组AMPKα的蛋白表达增加(与Control组相比,P<0.01)。4组间P-AMPKα、PGC-1α的表达均有统计学差异(F分别为17.496、13.421,P均<0.01),缺氧预处理及缺氧刺激均可上调2种蛋白的表达(与Control组相比,P<0.05),Hyp+OGD组较OGD组蛋白表达的增加更明显(P<0.05)。结论缺氧预处理可产生细胞保护作用,缺氧预处理后AMPK可能通过PGC-1α促进ATP的生成,进而发挥重要的细胞保护作用。

偏侧咀嚼致大鼠咬肌肌纤维代谢特征改变及其腺苷酸活化蛋白激酶调节机制

目的探讨偏侧咀嚼对大鼠咬肌肌纤维代谢特征的影响及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对肌纤维代谢特征变化的调控作用。方法拔除大鼠右上颌磨牙建立偏侧咀嚼大鼠模型,实验组分为2、4、6、8周组,设同期对照组。应用辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶(NADH-TRase)染色法检测咬肌肌纤维有氧代谢类型以及各型肌纤维的分布密度和构成比;用Western blot技术检测p-AMPK(Thr172)/AMPKα1表达水平。结果与同期对照组比较,建模2周实验组拔牙侧深染型肌纤维比例增多,非拔牙侧中染型纤维比例增加,浅染型肌纤维比例减少(P<0.05);建模4、6、8周组双侧深染型肌纤维比例持续增加,拔牙侧显著高于非拔牙侧;第6、8周组双侧中染型肌纤维比例下降(P<0.05);拔牙侧浅染肌纤维比例在8周组减少,非拔牙侧无明显改变(P>0.05)。p-AMPK(Thr172)/AMPKα1表达水平在2、4周拔牙侧较对照组和非拔牙侧增高(P<0.05),在非拔牙侧各周组无显著改变(P>0.05)。结论偏侧咀嚼可促进双侧咬肌肌纤维有氧代谢能力且伴随表型特征的改变,在非工作侧更明显;肌纤维有氧代谢能力增强与AMPK通路的激活有关。

血清AMPK-αmRNA、Caspase-6 mRNA水平对非酒精性脂肪肝疗效的预测价值及影响因素分析

目的 分析血清腺苷酸活化蛋白激酶-αmRNA(Adenosine monophosphate activated protein kinase α,AMPK-αmRNA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6(Cystein-asparate protease,caspase-6) mRNA水平对非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)疗效的预测价值及影响因素。方法 选取2021年10月-2023年8月聊城市人民医院感染性疾病科收治的188例NAFLD患者为研究对象,治疗6个月后以甘油三酯(TG)降低≥20%和(或)总胆固醇(TC)降低≥10%判断为治疗有效,归入有效组,否则判断为治疗无效,归入无效组。所有患者治疗前后检测血清AMPK-αmRNA、Caspase-6 mRNA水平。收集NAFLD患者一般资料,分析NAFLD疗效的影响因素。绘制受试者工作特征(Receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析血清AMPK-αmRNA,Caspase-6 mRNA水平对NAFLD疗效的预测价值。结果 188例NAFLD患者治疗6个月脱落6例,有效随访182例,其中治疗有效126例(69.23%),纳入有效组,治疗无效56例(30.77%),纳入无效组。与本组治疗前比较,治疗6个月后患者血清AMPK-αmRNA水平升高,Caspase-6 mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与无效组比较,有效组治疗前、治疗6个月血清AMPK-αmRNA水平升高,Caspase-6 mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。患有糖尿病,血清TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein,LDL-C)、谷丙转氨酶(Alanime aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST),Caspase-6 mRNA水平是NAFLD疗效的独立危险因素,治疗前血清AMPK-αmRNA水平是其独立保护因素(P<0.05)。建立Logistic回归模型:logit(P)=-29.182-0.867×AMPK-αmRNA+0.890×Caspase-6 mRNA+1.956×糖尿病+1.283×TG+0.982×TC+0.703×LDL-C+0.066×ALT+0.101×AST,拟合度较好。治疗前血清AMPK-αmRNA、Caspase-6 mRNA水平及Logistic回归模型预测NAFLD疗效的曲线下面积(Area under curve,AUC)值分别为0.757、0.717、0.816,Logistic回归模型的预测价值大于AMPK-αmRNA,Caspase-6 mRNA单独评估价值(Z=2.149,P=0.032;Z=2.879,P=0.004)。结论 患者是否患有糖尿病,血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST、AMPK-αmRNA、Caspase-6 mRNA水平是NAFLD疗效的影响因素,检测血清AMPK-αmRNA、Caspase-6 mRNA水平对NAFLD疗效具有一定预测价值。

腺苷酸活化蛋白激酶在纤维化发生中的作用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被认为是调节能量稳态和代谢应激反应的能量传感器,是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,由调节性β(β1和β2)和γ(γ1、γ2和γ3)亚单位以及催化性α(α1和α2)亚单位组成[1],其中α亚基含有催化核心的N端激酶结构域(kinase domain,KD),Thr172位点的磷酸化可使AMPK活性增加超过100倍,被认为是AMPK活化的标志。C末端结合β、γ亚基并含有重要的调节结构域,即当AMP水平下降时,可以抑制AMPK活化的自身抑制结构域(autoinhibitory domain,AID)和富含丝氨酸/苏氨酸的结构域“ST环”(ST-loop)[2-3];β亚基的N端有碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)将AMPK固定在细胞膜上,而N端区域之后紧跟着α、γ结合区域[4],因此,β亚基相当于1个与α和γ亚基结合的支架,使AMPK形成稳定的异源三聚体[5];γ亚基的N末端包含4个串联的胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)重复序列,形成2个可以结合AMP或ATP分子的Bateman结构域[6]。

微小RNA-19a-3p对充血性心力衰竭模型大鼠心肌纤维化的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA-19a-3p(miR-19a-3p)对充血性心力衰竭(CHF)模型大鼠心肌纤维化的影响及机制。方法:将60只SD大鼠随机分为NC组、Model组、NC agomir组(尾静脉注射NC agomir)、miR-19a-3p agomir组(尾静脉注射miR-19a-3p agomir)、miR-19a-3p agomir+腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂Compound C组(尾静脉注射miR-19a-3p agomir和250μg/kg Compound C),每组12只。NC组仅暴露腹主动脉而不结扎,其他组均构建CHF模型。给药结束后,比较各组大鼠血流动力学参数[左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)]和心脏功能指标[左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、室间隔厚度(IVS)、左心室功能(LVEF)]。Masson染色检测心肌纤维化情况。Western blot检测大鼠心肌组织Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、转化生长因子-β(TGF-β)及通过调控AMPK/沉默信息调节因子1(SIRT1)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)通路相关蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测大鼠心肌组织miR-19a-3p的相对表达量。结果:与NC组比较,Model组大鼠心肌纤维化程度加重,LVSP、+dp/dtmax、LVEF、miR-19a-3p表达水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达降低,LVESD、LVEDD、IVS及CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β蛋白表达升高(均P<0.05)。与Model组、NC agomir组比较,miR-19a-3p agomir组大鼠心肌纤维化程度改善,LVSP、+dp/dtmax、LVEF、miR-19a-3p表达水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达升高,LVESD、LVEDD、IVS及CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β蛋白表达降低(均P<0.05)。与miR-19a-3p agomir组比较,miR-19a-3p agomir+Compound C组大鼠心肌纤维化程度加重,LVSP、+dp/dtmax、LVEF及p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达降低,LVESD、LVEDD、IVS及CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β蛋白表达升高(均P<0.05),而miR-19a-3p表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达miR-19a-3p可能通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路抑制CHF大鼠心肌纤维化。

微小RNA-21对脓毒症小鼠急性肺损伤的改善作用及其机制

目的 观察微小RNA-21 (miR-21)对脓毒症小鼠急性肺损伤(ALI)的改善作用,并探讨其可能作用机制。方法 40只雄性昆明小鼠随机分为miR-21前体+ALI组(Pre-miR-21+ALI组)、miR-21前体+磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)抑制剂LY294002+ALI组(Pre-miR-21+LY+ALI组)、PI3K/Akt抑制剂LY294002+ALI组(LY+ALI组)、ALI组、假手术组,每组各8只。ALI组小鼠采用盲肠结扎穿孔术(CLP)造成脓毒症ALI;Pre-miR-21+ALI组小鼠先尾静脉注射miR-21前体腺病毒0.2mL (1×10^(9)pfu/mL),4天后采用CLP造成脓毒症ALI;Pre-miR-21+LY+ALI组小鼠先尾静脉注射miR-21前体腺病毒0.2ml(1×10^(9)pfu/mL),4天后尾静脉注射LY (0.3 mg/g),注射30 min后进行CLP;LY+ALI组小鼠先尾静脉注射LY(0.3 mg/g),注射30 min后进行CLP;假手术组小鼠仅开腹探查盲肠。干预24 h时麻醉各组小鼠后取腹主动脉血,测算各组小鼠氧合指数(OI),采用ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-6和氧化应激指标ROS、SOD;处死各组小鼠后取右肺组织,HE染色观察肺组织病理学变化,测算肺组织肺湿重/干重比值(W/D);取各组小鼠左肺组织,采用qRT-PCR法检测miR-21,采用WESTERN Blotting法检测各组小鼠左肺组织磷脂酶和张力蛋白同源物(PTEN)、磷酸化Akt (p-Akt)蛋白。结果 与假手术组比较,ALI组小鼠OI下降,血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、肺组织W/D、miR-21表达升高(P均<0.05),光镜下可见肺泡结构破坏、肺泡出血,PTEN蛋白相对表达量下降,p-Akt蛋白相对表达量增加(P均<0.05);与ALI组比较,Pre-miR-21+ALI组小鼠OI高,血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、肺组织W/D降低,miR-21相对表达量高(P均<0.05),光镜下可见肺泡结构破坏、肺泡出血减轻,PTEN蛋白相对表达量下降,p-Akt蛋白相对表达量增加(P均<0.05);与ALI组比较,Pre-miR-21+LY+ALI组OI降低,血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、肺组织W/D、miR-21相对表达量升高(P均<0.05),光镜下可见肺泡结构破坏、肺泡出血加重,PTEN蛋白相对表达量下降,p-Akt蛋白相对表达量升高(P均<0.05);与ALI组比较,LY+ALI组OI降低,血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、肺组织W/D升高(P均<0.05),肺泡结构破坏、肺泡出血加重;与Pre-miR-21+LY+ALI组比较,LY+ALI组OI降低,血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、肺组织W/D升高,miR-21相对表达量下降(P均<0.05),光镜下可见肺泡结构破坏、肺泡出血加重,PTEN蛋白相对表达量升高,p-Akt蛋白相对表达量下降(P均<0.05)。结论 尾静脉预注射miR-21前体腺病毒的脓毒症小鼠急性肺损伤程度较轻,肺组织PTEN蛋白相对表达量低、p-Akt蛋白相对表达量高。miR-21可能通过抑制肺组织PTEN表达、促进p-Akt表达,减轻脓毒症小鼠肺组织炎症反应和氧化应激水平,从而减轻脓毒症小鼠ALI。

微RNA-375-5p对心力衰竭大鼠的保护作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-375-5p对心力衰竭(HF)大鼠的保护作用及相关机制。方法将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+Compound C(CC)组,每组10只。HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+CC组大鼠腹腔注射阿霉素溶液制备HF模型,假手术组大鼠腹腔注射等量的NaCl溶液。造模结束后次日,miR-375-5p组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL,miR-NC组大鼠经尾静脉注射miR-NC mimics 100μL,假手术组和HF组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水,miR-375-5p+CC组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂CC(0.2 mg·kg^(-1));各组大鼠均每日给药1次,连续给药4周。使用彩色多普勒超声仪检测各组大鼠心功能指标,反转录聚合酶链反应检测各组大鼠心肌组织中miR-375-5p表达,酶联免疫吸附试验检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平,苏木精-伊红染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况,蛋白质印迹检测各组大鼠心肌组织中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、AMPK、沉默信息调节因子3(SIRT3)蛋白的相对表达量。结果与假手术组比较,HF组、miR-NC组和miR-375-5p组大鼠的左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。miR-NC组与HF组大鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率、血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、GSH水平、SOD活性、心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量及SIRT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与HF组相比,miR-375-5p组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平、心肌组织中p-AMPK/AMPK及miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著升高,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著降低(P<0.05)。与miR-375-5p组相比,miR-375-5p+CC组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。假手术组大鼠心肌细胞规律排列,细胞核明显且无炎症细胞浸润;HF组大鼠心肌细胞形态发生明显改变,排列紊乱,细胞间隙变大,染色变浅,且出现心肌纤维化,有大量的炎症细胞浸润,HF组和miR-NC组大鼠心肌组织病理学变化无明显差异;与HF组相比,miR-375-5p组大鼠心肌细胞排列明显有序,细胞坏死程度和范围明显减少;miR-375-5p+CC组与HF组大鼠心肌组织病理学变化相似。结论miR-375-5p能抑制HF大鼠心肌细胞凋亡,进而对HF大鼠发挥保护作用,其机制可能与激活AMPK/SIRT3信号通路有关。

人巨细胞病毒微小RNA UL112调控血管内皮细胞mRNA的研究

目的探讨人巨细胞病毒RNA UL112对人血管内皮细胞mRNA表达的影响。方法构建人巨细胞病毒微小RNA UL112腺病毒过表达载体并使其感染人原代脐静脉内皮细胞作为转染组,感染无义空白腺病毒载体的脐静脉内皮细胞为对照组。检测人巨细胞病毒微小RNA UL112对脐静脉内皮细胞mRNA表达谱的影响。结果与对照组相比,转染组mRNA存在差异表达基因365个,其中表达基因上调303个,下调62个,差异表达基因富集于丝裂原活化蛋白激酶通路。结论人巨细胞病毒微小RNA UL112影响脐静脉内皮细胞mRNA的表达。

LncRNA PFL通过AMPK-PPARα信号通路改善心肌纤维化

目的研究促纤维化长链非编码RNA(LncRNA PFL)改善压力负荷诱导的心肌纤维化同腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-过氧化物酶增殖激活的α亚型受体(PPAR)α信号通路的激活是否相关。方法将60只大鼠随机分为A(假手术)组、B(压力负荷诱导的心肌纤维化模型)组、C(压力负荷诱导的心肌纤维化模型+LncRNA PFL抑制剂)组。采用苏木素-伊红(HE)染色检测心肌组织的病理形态和纤维化程度,羟脯氨酸(HYP)检测心肌质量,Western印迹测定心肌组织中AMPK、PPARα蛋白水平。结果与A组比较,B组和C组心脏重量指数(HWI)和左心室重量指数(LVWI)均显著升高(P<0.01);与B组比较,C组显著下降(P<0.01)。HE染色结果:与A组比较,B组和C组心肌细胞的炎症浸润和细胞间胶原纤维均显著增加,神经元细胞损伤程度加重(P<0.05);与B相比,C组显著好转(P<0.05)。免疫荧光结果:B组AMPK及PPARα蛋白水平明显低于A组和C组,且C组明显低于A组。RT-qPCR及Western印迹结果:B组心肌组织中AMPK和PPARαmRNA及蛋白表达显著低于A组和C组,且C组显著高于A组(P<0.05)。结论LncRNA PFL表达下调改善压力负荷诱导的心肌纤维化与激活AMPK-α信号通路有关。

AMPK活化对骨骼肌中MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA的表达和3-MH含量的影响

通过给SD大鼠注射AMPK激动剂AICAR,提高大鼠骨骼肌中AMPK的活性,探讨AMPK活性变化对骨骼肌蛋白质降解的作用。采用同位素技术测定腓肠肌中AMPK活性的变化;采用实时荧光定量PCR技术,测定腓肠肌中MuRF1、MAFbx基因表达量的变化。结果显示AICAR注射后1、2、7 h,AMPK活性与对照组相比升高,差异有显著性或非常显著性意义(P<0.05或P<0.01);AICAR注射后7 h,AMPK活性开始下降。AICAR注射后1、2 h,MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA表达量与对照组相比升高,分别升高2.45、2.23倍和2.67、2.30倍,差异有非常显著性意义(P<0.01);AICAR注射后7 h,MuRF1 mRNA表达量升高了2.01倍,差异有显著性意义(P<0.05);而MAFbx mRNA表达有升高趋势,但差异没有显著性。3-MH质量摩尔浓度各组间差异没有显著性意义。结果说明:(1)大鼠一次性注射AICAR后,能显著提高骨骼肌中AMPK的活性,AMPK活性的升高能促进MAFbx mRNA和MuRF1 mRNA的表达,促进骨骼肌蛋白质的降解;(2)推测在反映骨骼肌蛋白质降解方面,MAFbx mRNA和MuRF1 mRNA比3-MH的敏感度要高。

人肺动脉平滑肌细胞中微小RNA-210通过MKP-1负性调节低氧下细胞的增殖

目的：研究低氧条件下人肺动脉平滑肌细胞中微小RNA-210（miR-210）与丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）的关系,是否通过MKP-1调节肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制。方法：选用4-8代的人肺动脉平滑肌细胞,共分为12组,其中21%O2正常氧及1%O2低氧培养箱各6组,分别给予转染miR-210抑制剂、增强剂、MKP-1 siRNA等处理,提取RNA和miRNA,并采用实时定量PCR法检测各组平滑肌细胞中miR-210和MKP-1mRNA的表达,提取蛋白,并用Western blotting法比较各组MKP-1蛋白水平的表达,MTT法检测肺动脉平滑肌细胞的增殖情况。结果：低氧下,人肺动脉平滑肌细胞中miR-210及MKP-1的表达均明显增加,抑制miR-210表达使MKP-1的表达增加并可抑制低氧诱导的细胞增殖,miR-210的过表达可抑制低氧诱导的MKP-1表达上调,但不影响细胞增殖,MKP-1基因沉默后,低氧下miR-210抑制剂对细胞增殖的抑制作用消失。结论：低氧下的人肺动脉平滑肌细胞中,MKP-1是miR-210的一个新的靶基因,MKP-1可以介导miR-210抑制剂对人肺动脉平滑肌细胞增殖的负性调节作用。

激活AMPK通过下调微小RNA-21水平抑制肺癌细胞增殖及侵袭能力

目的探讨激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是否可抑制人肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭及其具体作用机制,为防治肺癌寻求新靶点。方法以培养的人A549肺腺癌细胞株为研究对象,外源性给予AMPK激动剂二甲双胍干预细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况,采用逆转录(RT)-PCR法检测各组细胞微小RNA-21 (miR-21)水平,蛋白免疫印迹法检测各组细胞p-/t-AMPK、PTEN、p-/t-Akt水平,Transwell实验检测迁移及侵袭情况。结果二甲双胍可抑制A549细胞增殖、迁移及侵袭能力,对穿膜细胞数计数后进行统计学分析,组间存在差异(P均<0.05,与对照组比较);二甲双弧可通过激活AMPK下调细胞miR-21水平,上调PTEN表达,抑制Akt活性抑制A549细胞增殖及迁移侵袭(P均<0.05,与对照组比较);转染miR-21 mimics可逆转AMPK的作用(P均<0.05,与二甲双胍组比较)。结论通过上调PTEN表达,下调miR-21水平可抑制A549细胞的增殖及迁移侵袭,提示激活AMPK具有潜在治疗肺癌的作用,为研发新的靶向治疗药物提供了思路。