二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调节胶原诱导性关节炎大鼠辅助性T细胞17／调节性T细胞的分化及细胞因子的表达

目的以胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠为模型，观察二甲双胍对CIA大鼠血清细胞因子、脾脏辅助性T细胞17（Th17）及调节性T细胞分化的影响和脾脏腺苷酸活化蛋白酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AMPK—mTOR）的表达，初步探讨二甲双弧治疗RA的可能机制。方法使用牛Ⅱ型胶原建立CIA大鼠模型，将大鼠随机分为模型组、二甲双胍-30mg／kg（Met-30mg／kg）组、二甲双胍-100mg／kg（Met-100mg／kg）组、二甲双胍-300mg／kg（Met-300mg／kg）组及对照组，分别给予相应的处理。记录大鼠足趾容积，每周1次，初次免疫后第35天取得标本，采用ELISA检测各组大鼠血清TNF－α、IL-6、IL-1β、IL-17，采用流式细胞术分析各组大鼠脾脏Th17、调节性T细胞表达，采用蛋白印迹法检测各组大鼠脾脏AMPK、mTOR及p-AMPK、p—roTOR的表达。采用单因素方差分析进行统计分析。结果足趾容积在初次免疫后第35天时二甲双胍-100mg／kg组[（2．43±0．37）ml，t=2．97，P〈0.05]、二甲双胍-300mg／kg组[（2．58±0．21）ml，t=2．96，P〈0．05]明显低于模型组（2．97±0．23）ml。初次免疫后第35天，各治疗组的血清细胞因子[二甲双胍-300mg／kg组TNF－α（104±8）pg／ml，t=42．77，P〈0．05；IL—1β（183±24）pg／ml，t=60．457，P〈0．05；IL-6（19.3±2．8）pg／ml，t=53．62，P〈0．05；IL-17（64．5±6．7）pg／ml，t=47．92，P〈0．05]均明显低于模型组[TNF－α（246±8）pg／ml；IL-1β（1336±40）pg／ml；IL-6（87．0±5．1）pg／ml；IL-17（282．3±6．8）pg／m1]，二甲双胍-300mg／kg组脾脏Th17[（6．57±0．39）％，t=8．74，P〈0．05]较模型组[（9．89±0．53）％]明显减少、调节性T细胞明显增多[（7．60±0．45）％与（3．94±0．61）％，t=8．37，P〈0．05]、Th17／调节性T细胞比值明显下降（0．87±0．10与2．55±0．47，t=6．98，P〈0．05）且与对照组相近（0．67±0．04，t=1．08，P〉0．05），予二甲双胍治疗组的脾脏p-AMPK、p—roTOR水平均与模型组差异有统计学意义（均P〈0．05）。结论二甲双胍可有效减轻CIA病情，可能通过AMPK—roTOR信号通路使脾脏Th17表达减少、调节性T细胞表达增多，调节Th17，调节性T细胞比例，并减少血清促炎细胞因子IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，达到治疗CIA的作用。

腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路介导线粒体自噬在男性生殖中的研究进展

线粒体自噬是指细胞利用自噬机制选择性地降解受损或多余线粒体的过程。近年来,有证据表明线粒体自噬在男性生殖中至关重要,其可清除异常的线粒体,从而减少氧化应激并维持生殖细胞的能量稳态。作为调控细胞生长代谢的经典通路,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路通过产生自噬装置,调控线粒体蛋白,可促进自噬体包裹线粒体等过程,从而介导线粒体自噬。本文对AMPK-mTOR通路在下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中枢水平及性腺水平调节线粒体自噬的机制作一综述,以期为改善精子质量提供新的观点和思路。

基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路探讨柚皮素对视网膜微血管内皮细胞的损伤机制研究

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路探讨柚皮素(NAR)对人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的损伤机制。方法 将HRMECs随机分为对照组、高糖(HG)组、HG+NAR组(3 mg/L NAR)、HG+激活剂(AICAR)组(1 mmol/L AICAR)、HG+NAR+AICAR组(3 mg/L NAR+1 mmol/L AICAR);除对照组向培养基中加入5 mmol/L的D-葡萄糖处理外,其他各组均向培养基中加入30 mmol/L的D-葡萄糖处理。采用CCK-8及Transwell分别检测细胞增殖及迁移情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测自噬因子LC3 mRNA、p62 mRNA表达水平;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测AMPK/mTOR通路及自噬相关蛋白表达水平。结果 与对照组相比,HG组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+NAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,但HG+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+NAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+AICAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NAR可减轻HG诱导的HRMECs损伤,其机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的自噬有关。

橘皮素通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调控细胞自噬促进大鼠腹主动脉瘤发生发展的机制

目的探讨橘皮素通过腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控细胞自噬促进大鼠腹主动脉瘤(AAA)发生发展的机制。方法选取无特定病原体级SD雌性大鼠45只,其中20只大鼠皮下埋植0.9%氯化钠注射液缓释泵(对照组),剩余25只大鼠皮下埋植血管紧张素Ⅱ缓释泵(AAA组)构建AAA模型。造模过程中AAA组大鼠死亡5只,共20只造模成功。对照组予0.9%氯化钠注射液灌胃,AAA组予橘皮素灌胃1次/d,持续7 d。观察大鼠主动脉血管平滑肌细胞活力、细胞凋亡率、细胞迁移率,比较2组细胞蛋白水平、自噬细胞基因表达量、细胞因子水平及AMPK/mTOR信号通路表达量。结果AAA组细胞活力高于对照组,细胞凋亡率、细胞迁移率均低于对照组(均P<0.05);β-连环蛋白、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)相关X蛋白水平均低于对照组,细胞周期蛋白D1、Bcl-2水平均高于对照组(均P<0.05);Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34、LC3基因表达量均低于对照组(均P=0.001);白细胞介素6、正常T淋巴细胞表达和分泌的细胞因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、单核细胞趋化蛋白1水平均低于对照组(均P<0.05);AMPK、mTOR表达量均高于对照组[(1.61±0.35)比(1.10±0.21)、(2.11±0.14)比(1.13±0.06)](均P=0.001)。结论橘皮素对AAA大鼠细胞蛋白水平、自噬细胞水平及转化生长因子水平有调节作用,其作用机制可能与AMPK/mTOR信号通路调控相关。

基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白介导的自噬途径研究齐墩果酸预处理大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)介导的自噬途径研究齐墩果酸(OA)预处理大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法56只大鼠随机分为假手术组、模型组、OA组、OA联合AMPK抑制剂组,每组14只,除假手术组外,其余各组左冠状动脉前降支结扎45 min再灌注2 h建立MIRI大鼠模型,实验前3 d用100 mg/kg OA灌胃预处理OA组、OA联合AMPK抑制剂组,OA联合AMPK抑制剂组同时腹腔注射20 mg/kg Compound C。再灌注2 h后,检测室性期前收缩(PVCs)及室性心动过速/心室颤动(VT/VF)发生次数;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死体积,计算梗死百分比;苏木精-伊红(HE)染色检测心肌组织形态情况;电镜观察大鼠心肌细胞超微结构情况;免疫印迹法检测心肌组织中微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、p62、Beclin1、AMPK、磷酸化(p)-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白等表达情况。结果与假手术组相比,模型组PVCs、VT/VF、心肌梗死百分比、心肌组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达升高,p62、p-mTOR/mTOR蛋白水平降低(P<0.05),心肌细胞产生明显的自噬性损伤。与模型组相比,OA组PVCs、VT/VF、心肌梗死百分比、心肌组织中p62、p-mTOR/mTOR蛋白水平降低(P<0.05),心肌组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达升高(P<0.05),心肌细胞自噬性损伤减轻。与OA组相比,OA联合AMPK抑制剂组PVCs、VT/VF、心肌梗死百分比、心肌组织中p62、p-mTOR/mTOR蛋白水平升高(P<0.05),心肌组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达降低(P<0.05),心肌细胞自噬性损伤加重。结论OA预处理可能通过激活AMPK/mTOR介导的自噬途径从而实现对MIRI大鼠的保护。

薯蓣皂苷元通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路增强前列腺癌细胞放疗敏感性的实验研究

目的探究薯蓣皂苷元(DG)增强前列腺癌(PCa)细胞放疗敏感性的作用机制。方法CCK-8检测细胞增殖活力;集落形成实验检测细胞集落形成率;酶联免疫吸附试验检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;免疫荧光分析细胞中γH2AX焦点形成数;免疫印迹分析细胞中增殖、凋亡及腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)通路相关蛋白的表达。结果当X线(IR)≥4Gy、DG≥25μM时,PCa细胞增殖活力被明显抑制(P<0.05)。DG干预可有效改善IR处理对PCa细胞增殖能力、LDH漏出率、细胞凋亡、γH2AX焦点形成数及AMPK/mTOR通路相关蛋白的影响。AMPK抑制剂Compound C具有与DG相反的效果,且可部分逆转DG对以上指标的影响(P<0.05)。结论DG通过激活AMPK/mTOR通路增强PCa细胞放疗敏感性。

α-硫辛酸通过激活腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路改善糖尿病肾脏疾病的研究

目的探讨α-硫辛酸(LA)通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路改善T2DM大鼠肾脏病变。方法 40只大鼠分为正常对照组(Con)、T2DM组、LA组、复合物C组(Comp C)和LA+Comp C组,每组各8只。检测各组大鼠FPG、24 h尿蛋白水平,计算肾脏肥大指数,光镜和电镜观察大鼠肾脏病理变化,Weatern blot检测大鼠肾脏相关蛋白表达水平。结果与NC组比较,T2DM组FPG、肾脏肥大指数、24 h尿蛋白升高(P<0.01),光镜和电镜下均可见肾脏组织病变严重,p-AMPK、哺乳动物ATG6同源蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)II蛋白表达降低(P<0.01),p-mTOR、p62蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。与T2DM组比较,LA组肾脏肥大指数、24 h尿蛋白降低(P<0.01),肾脏病理学改变有所改善,p-AMPK、Beclin-1、LC3BII蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01),p-mTOR、p62蛋白表达减少(P<0.05或P<0.01)。与LA组比较,LA+Comp C组p-AMPK、Beclin-1、LC3BII水平降低(P<0.05或P<0.01),p-mTOR、p62水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论 T2DM大鼠肾脏组织中AMPK/mTOR通路受抑制,应用LA可激活此通路,延缓DKD进展。

沙格列汀干预非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病大鼠肝组织AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路蛋白表达变化

目的探讨沙格列汀干预非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)合并2型糖尿病(T2DM)大鼠对肝组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-转录因子EB(TFEB)自噬信号通路蛋白表达的影响。方法将42只大鼠随机分为对照组、模型组和沙格列汀干预组,每组14只。采用高脂饲料喂养和链脲佐菌素腹腔注射构建NAFLD合并T2DM模型。在建模成功后,分别给予沙格列汀或生理盐水灌胃8 w。采用放射免疫法检测空腹胰岛素(INS,使用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。采用Western bloting法检测肝组织p-AMPK、mTOR、TFEB和自噬标记物LC3B-II蛋白表达。结果沙格列汀处理组大鼠体质量、肝质量和肝脏指数分别为(341.53±5.15)g、(11.06±0.49)g和(3.32±0.25)%,显著低于模型组【分别为(353.27±8.74)g、(12.77±0.84)g和(3.67±0.18)%,P<0.05】;FPG、INS和HOMA-IR水平分别为(9.45±0.71)mmol/L、(7.92±0.34)mIU/L和(3.44±0.36),显著低于模型组【分别为(13.97±0.92)mmol/L、(14.57±0.84)mIU/L和(9.03±0.91),P<0.05】;TC、TG、ALT和AST水平分别为(3.79±0.17)mmol/L、(0.81±0.13)mmol/L、(68.76±4.11)IU/L和(54.49±5.21)IU/L,均显著低于模型组【分别为(4.05±0.20)mmol/L、(2.04±0.15)mmol/L、(119.73±3.94)IU/L和(83.27±7.68)IU/L,P<0.05】;肝组织p-AMPK、TFEB和LC3B-II表达分别为(1.13±0.11)、(1.23±0.13)和(1.17±0.12),显著强于模型组【分别为(0.62±0.07)、(0.48±0.05)和(0.37±0.04)】,而mTOR表达为(0.89±0.08),显著弱于模型组【(1.53±0.16),P<0.05】。结论沙格列汀可能通过调控AMPK/mTOR-TFEB自噬信号通路显著降低NAFLD合并T2DM大鼠血糖和血脂水平,改善肝脂肪变。

IL-1β通过PI3K/Akt/mTOR途径促进神经元活化

目的:观察白细胞介素-1β(IL-1β)刺激对神经元活化的影响。方法:利用IL-1β刺激体外培养的原代神经元,运用慢病毒转染shRNA使PI3K的p85亚基(PI3K-p85)沉默、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)抑制剂雷帕霉素预处理阻断m TOR、酪氨酸激酶家族抑制剂PP2抑制p85向IL-1受体I型(IL-1RI)募集等方式预处理神经元,检测PI3K-p85、与IL-1RI结合的PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K以及微管相关蛋白2(MAP2)在神经元内的变化及相互作用;利用FM4-64染色观察各组神经元突触胞吞情况。结果:利用IL-1β刺激体外培养的海马神经元可增加细胞内PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K、MAP2以及与IL-1RI结合的PI3K-p85的水平(P<0.05),并且神经元突触的胞吞作用明显加剧(P<0.05);抑制PI3K-p85可以下调IL-1β所致的p-Akt、pp70S6k和MAP2水平增加(P<0.05),神经元突触的胞吞作用减弱(P<0.05);抑制m TOR也能下调IL-1β所致的PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K和MAP2水平增加(P<0.05),神经元突触的胞吞作用减弱(P<0.05);抑制p85亚基与IL-1RI的结合也可以下调IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6K和MAP2水平增加(P<0.05)。结论:促炎因子IL-1β通过IL-1RI与PI3K-p85结合使PI3K-p85活化,进而磷酸化Akt和m TOR下游物质p70S6K,促进神经元突触增生及活化,这可能是内侧颞叶癫痫向慢性化进展的机制之一。

枸杞多糖基于AMPK-mTOR通路对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠神经元保护作用研究

目的研究枸杞多糖基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠神经元的保护作用。方法将45只雄性SD大鼠随机分为对照组、帕金森病组及枸杞多糖组,每组15只。枸杞多糖组给予枸杞多糖水溶液50 mg/kg灌胃预处理,帕金森病组及对照组给予等量蒸馏水灌胃预处理,均1次/d,持续3 d。预处理结束后,帕金森病组及枸杞多糖组采用颈背部皮下注射鱼藤酮方法建立帕金森病模型,对照组颈背部皮下注射等量溶剂。注射3 h后,枸杞多糖组给予枸杞多糖水溶液50 mg/kg灌胃,对照组及帕金森病组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d,连续28 d。干预结束后,使用透射电镜技术观察各组大鼠黑质溶酶体数目及线粒体损伤情况,采用ELISA法测定各组大鼠纹状体线粒体氧化呼吸酶Ⅰ及AMPK-mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR含量。结果透射电镜显示,对照组大鼠线粒体形态正常;帕金森病组大鼠黑质内神经元出现线粒体肿胀变性、嵴消失等不可逆性损伤;与帕金森病组相比,枸杞多糖组大鼠神经元内溶酶体增多,线粒体发生可逆性的轻度水肿。与对照组比较,帕金森病组大鼠纹状体线粒体氧化呼吸酶Ⅰ含量明显升高(P<0.05),p-AMPK/AMPK比值明显降低(P<0.05);与帕金森病组比较,枸杞多糖组大鼠纹状体线粒体氧化呼吸酶Ⅰ含量明显降低(P<0.05),p-AMPK/AMPK比值明显升高(P均<0.05);3组p-mTOR/mTOR比值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论枸杞多糖可通过AMPK-mTOR通路减少异常蛋白蓄积,减轻帕金森病大鼠黑质纹状体线粒体损伤,从而产生神经保护作用。

PI3K/AKT/mTOR信号通路在三阴乳腺癌靶向治疗中的研究进展

三阴乳腺癌(TNBC)为乳腺癌重要亚型,因其三阴性特点导致分子靶向治疗效果较差,临床多采用新辅助化疗治疗TNBC,但疗效一般,预后差。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点(PI3K/AKT/mTOR)信号通路及解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)在多种肿瘤中都出现异常激活状态,是抗肿瘤的重要靶点。本文结合近年来相关文献,对PI3K/AKT/mTOR信号通路及ADAM17在肿瘤发生中的作用机制、相关靶点及TNBC靶向治疗中的研究进行汇总与分析,以期为多靶点联合治疗TNBC提供新思路。

芪红胶囊对缺血性心力衰竭大鼠心肌线粒体能量代谢及AKT/AMPK-mTOR信号通路的影响

目的:探讨芪红胶囊基于蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶(AKT/AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠线粒体能量代谢的影响及调控机制。方法:将36只雄性SD大鼠随机选取6只作为假手术组,另30只作为模型组。模型组采用冠状动脉左前降支结扎法制备IHF模型。将造模成功的大鼠按体质量随机分为5组:模型组、阳性药组、芪红胶囊低剂量组[QH-L组,0.324 g/(kg·d)]、芪红胶囊中剂量组[QH-M组,0.648 g/(kg·d)]、芪红胶囊高剂量组[QH-H组,1.296 g/(kg·d)],给予相应浓度的药物溶液灌胃,假手术组、模型组给予等体积的生理盐水(10 mL/kg),各组均每日灌胃1次。连续干预4周后,选用M型超声测定左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)判定心脏结构及心功能;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色法观察心肌组织病理形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清葡萄糖(Glu)、乳酸(LD)、酮体(KB)、游离脂肪酸(FFA)水平;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)检测细胞线粒体膜电位;线粒体通透性转换孔(mPTP)检测试剂盒检测其荧光强度;MitoSOX^(TM)Red线粒体超氧化物指示剂检测线粒体活性氧(ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织AKT、AMPK、mTOR的蛋白表达量。结果:与假手术组比较,模型组LVEDD、LVESD、凋亡率、Glu、LD、FFA、KB、线粒体膜电位、ROS、磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白表达水平均升高(P<0.05),LVEF、FS、mPTP及磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达水平均下降(P<0.05);与模型组比较,芪红胶囊低、中、高剂量组和阳性药组Glu、LD、FFA、KB、线粒体膜电位、ROS水平明显下降(P<0.05),线粒体mPTP、p-AKT蛋白表达水平明显升高(P<0.05);芪红胶囊中、高剂量组LVEDD、凋亡率、p-AMPK明显降低(P<0.05),LVEF、FS明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与芪红胶囊低剂量组比较,芪红胶囊高剂量组和阳性药组大鼠LVEF、FS、线粒体mPTP、p-AKT水平明显升高,LVESD、ROS、p-AMPK表达水平下降(P<0.05)。结论:芪红胶囊可以调节IHF大鼠心肌代谢底物进程,减少ROS的过度生成保护线粒体功能,激活AKT上调mTOR活性抑制细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤,调控能量代谢,发挥心肌保护作用,其机制可能与AKT/AMPK-mTOR信号通路蛋白的表达有关。

6-姜辣素对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的探究6-姜辣素对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法不同浓度6-姜辣素处理人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞,使用CCK-8法检测6-姜辣素对乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用流式细胞仪检测6-姜辣素对乳腺癌凋亡的影响;6-姜辣素处理人乳腺癌细胞,应用Western印迹法检测促凋亡蛋白(Bad)、免抗人单克隆抗体(Bax)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白水平。结果6-姜辣素抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力,并呈浓度依赖性和时间依赖性;流式细胞仪检测细胞凋亡率,提示6-姜辣素促进乳腺癌细胞凋亡发生;6-姜辣素处理乳腺癌细胞,促进Bad和Bax表达,而抑制Bcl-2表达;同时,6-姜辣素促进p-AMPK的表达,抑制p-mTOR的表达。结论6-姜辣素通过激活AMPK/mTOR信号通路,抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡,发挥抗肿瘤功能。

miR-34a通过激活AMPK/mTOR通路增强鼻咽癌细胞顺铂敏感性

目的:探讨微小RNA(microRNA,miR)-34a对鼻咽癌细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测鼻咽癌顺铂耐药HNE1/DDP细胞和亲本HNE1细胞中miR-34a的表达水平。将HNE1/DDP细胞分为未转染组(正常培养)、miR-NC组(转染阴性对照)和miR-34a组(转染miR-34a模拟物),实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-34a表达,噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞对顺铂的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路相关蛋白AMPK、磷酸化(p)-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达水平。结果:与HNE1细胞比较,HNE1/DDP细胞中miR-34a表达水平明显降低(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-34a组细胞中miR-34a表达水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平及p-AMPK/AMPK水平明显升高,顺铂对细胞的半数抑制浓度(the half inhibitory concentration,IC_(50))、Bcl-2蛋白表达水平和p-mTOR/mTOR水平均明显降低(P<0.05)。结论:miR-34a过表达可通过诱导细胞凋亡增强鼻咽癌HNE1/DDP细胞顺铂敏感性,其作用机制可能与激活AMPK/mTOR通路有关。

MAPK与PI3K-AKT-mTOR通路双重抑制对去势抵抗性前列腺癌的作用机制研究

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-m TOR)通路双重抑制对去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的作用机制。方法采用Western blot检测细胞中前列腺癌细胞(DU145和LNCa P)的细胞外信号调节激酶5(ERK5)、m TOR含量。应用RNA干扰(RNAi)技术建立基因降表达细胞模型,分别建立ERK5降表达、m TOR降表达、ERK5和m TOR同时降表达细胞模型。MTT法检测不同基因降表达对前列腺癌细胞的增殖的影响。比较CYP17A1在m TOR降表达DU145细胞和正常细胞中的表达。MTT法检测分别加入m TOR抑制剂(替西罗莫司)和CYP17A1抑制剂(阿比特龙)的DU145细胞的抑制率。采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定ERK5和m TOR在前列腺癌、前列腺增生和CRPC组织中的表达。结果m TOR蛋白在DU145细胞中的表达显著高于LNCa P细胞(P<0.05)。ERK5降表达组、m TOR降表达组、ERK5+m TOR降表达组的LNCa P细胞的增殖未受显著抑制(P>0.05)。m TOR降表达组、ERK5+m TOR降表达组的DU145细胞抑制率显著高于ERK5降表达组(P<0.05)。CYP17A1在m TOR降表达DU145细胞中的表达显著低于正常DU145细胞,且呈剂量依赖(P<0.05)。替西罗莫司1μmol/L+阿比特龙0.5μmol/L组的DU145细胞抑制率显著高于单用替西罗莫司组和单用阿比特龙组(P<0.05)。ERK5和m TOR在前列腺癌和CRPC组织中均高表达,m TOR在CRPC组中的表达水平显著高于前列腺增生组和前列腺癌组(P<0.05)。结论m TOR蛋白在DU145细胞中、CRPC组织中表达显著高于ERK5,m TOR降表达能显著抑制DU145细胞增殖。提示CRPC以PI3K-Akt-m TOR通路高表达为主,m TOR对DU145细胞的抑制作用与其对CYP17A1的抑制作用有关,m TOR联合CYP17A1的抑制作用优于m TOR或CYP17A1的单独抑制。

HMGB1/AMPK/m-TOR信号通路对K562细胞自噬和化学治疗耐药的影响

目的:观察高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)对急性髓系白血病细胞株(human leukemiacell line,K562)自噬及化学治疗(化疗)耐药的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:体外培养K562细胞,分为化疗药物处理组、化疗药物处理对照组、HMGB1纯化蛋白预处理组、HMGB1纯化蛋白预处理对照组、HMGB1si RNA转染组和HMGB1 si RNA转染对照组,其中化疗药物处理组又分为长春新碱(v incristine,VCR)、足叶乙甙(etoposide,VP-16)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)、阿霉素(adriamycin,ADM)和三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)处理组。细胞计数试剂盒-8检测细胞活性;Western印迹检测HMGB1,微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associate protein1light chain3,LC3),腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,m-TOR)磷酸化蛋白表达水平;ELISA法检测细胞上清液HMGB1蛋白含量;单丹磺酰尸胺染色和透射电镜观察细胞自噬状态。结果:与相应对照组比较,各化疗药物处理组(VCR,VP-16,Ara-C,ADM和As2O3)的细胞活性均显著降低,HMGB1蛋白表达均显著上调(均P<0.05)。与相应对照组比较,HMGB1纯化蛋白预处理组的细胞活性显著增加(P<0.05),HMGB1蛋白表达显著上调(P<0.05)。与HMGB si RNA转染对照组比较,HMGB1si RNA转染组的细胞活性显著降低(P<0.05),HMGB1蛋白表达显著下调(P<0.05);与相应对照组比较,HMGB1纯化蛋白处理组中LC3-II表达明显增强(P<0.05),光镜下观察到自噬小体和自噬泡数量明显增加。同时,与相应对照组比较,HMGB1纯化蛋白处理组p-AMPKa的蛋白表达明显增强,而p-m TOR表达明显减弱(均P<0.05)。结论:HMGB1可能通过AMPK/m-TOR信号通路增强K562细胞自噬发挥化疗耐药性。

黑色素瘤靶向治疗药物研究进展

在过去的几年中,黑色素瘤发病机制及发展过程中涉及的致癌基因和信号通路得到了全面深入的研究,治疗方案也有了显著改善。目前,除已经在临床治疗中使用的靶向药物外,一些正在进行临床研究的待批准药物和正在进行基础研究的潜在药物也表现出良好的应用前景。促分裂原活化的蛋白激酶通路及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路作为导致黑色素瘤发生的重要途径,针对其中各靶点的抑制剂是目前研究的重点。同时,联合治疗改善了单一用药的高耐受性,增强了抗肿瘤活性,显示出明显优势,为临床治疗所用。

壮药双路通脑方对缺血-再灌注脑损伤大鼠神经元自噬和凋亡的影响

目的探讨壮药双路通脑方对缺血-再灌注(I/R)脑损伤大鼠神经元自噬和凋亡的影响及可能机制。方法SD大鼠随机分为假手术组,模型对照组,小、中、大剂量双路通脑方组,大剂量双路通脑方+AMPK激活剂AICAR组,每组18只。按照分组给予不同的药物干预7 d后,采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型。再灌注24 h后,评估大鼠神经功能缺损的程度;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积;苏木精-伊红(HE)染色观察缺血半影区海马CA1区神经元形态学变化;TUNEL染色检测神经元凋亡;透射电子显微镜观察自噬小体的形成;免疫荧光(IF)染色检测微管相关蛋白1轻链3(LC-3)-Ⅱ的表达;Western blotting检测自噬标志基因Beclin-1、LC3A/B、p62及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Unc-51样激酶1(ULK1)及其磷酸化蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组神经功能缺损评分、脑梗死体积、神经元凋亡率、自噬小体数量、LC3-Ⅱ阳性表达、海马组织Beclin-1蛋白水平和LC3-II/LC3-I、p-AMPK/AMPK、p-ULK1(S317)/ULK1比值显著升高,p62蛋白水平和p-mTOR/mTOR、p-ULK1(S757)/ULK1比值显著降低(P<0.05);与模型对照组比较,小、中、大剂量双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、神经元凋亡率、自噬小体数量、LC3-Ⅱ阳性表达、海马组织Beclin-1蛋白水平和LC3-II/LC3-I、p-AMPK/AMPK、p-ULK1(S317)/ULK1比值显著降低,p62蛋白水平和p-mTOR/mTOR、p-ULK1(S757)/ULK1比值显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;AICAR可明显减弱大剂量双路通脑方对脑I/R大鼠神经元自噬和凋亡的抑制作用。结论双路通脑方可能通过调控AMPK/mTOR信号通路,抑制神经元的过度自噬,减少神经元凋亡,进而发挥对脑I/R大鼠的神经保护作用。

苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及作用机制

目的 探讨苦参碱对食管癌Eca-109细胞自噬的影响及其可能的作用机制。方法 将传代培养的Eca-109细胞分为对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组。对照组细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,低、中、高浓度苦参碱组细胞分别加入终质量浓度为1.0、1.5、2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞的活性,免疫荧光细胞化学染色法检测各组细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)的定位及表达,Western blot法检测各组细胞中多聚蛋白62(P62)、LC3蛋白的相对表达量,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量,透射电子显微镜观察对照组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞的超微结构。另取传代培养的Eca-109细胞,将细胞分为对照组、自噬抑制剂组、苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组。对照组细胞加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,自噬抑制剂组细胞加入终浓度为7μmol·L^(-1)的3-甲基腺嘌呤(3-MA)溶液,苦参碱组细胞加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)的苦参碱溶液,自噬抑制剂+苦参碱组细胞先加入终浓度为7μmol·L^(-1) 3-MA溶液预孵育3 h,再加入终质量浓度为2.0 g·L^(-1)苦参碱溶液;培养24 h后,采用Western blot法检测各组细胞中Beclin1、LC3和肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 低、中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组细胞增殖抑制率显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组、低浓度苦参碱组、中浓度苦参碱组和高浓度苦参碱组Eca-109细胞质中均可见到红色荧光标记的LC3蛋白阳性表达。对照组细胞中LC3蛋白呈弥散状态;各浓度苦参碱组细胞中LC3蛋白呈斑点状态,且苦参碱浓度越高,细胞质中呈斑点状LC3蛋白越多。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量显著低于低浓度苦参碱组(P<0.05);中浓度苦参碱组与高浓度苦参碱组Eca-109细胞中P62蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低浓度苦参碱组与对照组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于对照组和低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。低、中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。中、高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于低浓度苦参碱组(P<0.05);高浓度苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1 mRNA的相对表达量显著高于中浓度苦参碱组(P<0.05)。对照组细胞中可见正常的细胞质、细胞器和细胞核,高浓度苦参碱组细胞质中可见大量大小不等的自噬泡,并可见包裹有细胞内容物的自噬体。自噬抑制剂组与对照组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05);苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著高于对照组和自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中Beclin1蛋白的相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均显著低于苦参碱组(P<0.05)。自噬抑制剂组Eca-109细胞中磷酸化LKB1(p-LKB1)/LKB1、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK显著低于对照组,磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR显著高于对照组(P<0.05);苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组,p-mTOR/mTOR显著低于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于对照组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组与对照组Eca-109细胞中p-mTOR/mTOR比较差异无统计学意义(P>0.05)。苦参碱组和自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著高于自噬抑制剂组,p-mTOR/mTOR显著低于自噬抑制剂组(P<0.05);自噬抑制剂+苦参碱组Eca-109细胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK显著低于苦参碱组,p-mTOR/mTOR显著高于苦参碱组(P<0.05)。结论 苦参碱可能通过调节LKB1/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达诱导食管癌Eca-109细胞发生自噬。

大鼠神经元通过NLGN3/mTOR/MMP-9通路促进U251细胞迁移

目的:探讨肿瘤微环境中神经元对胶质瘤细胞迁移能力的影响。方法:分离培养胚胎18 d(E18)大鼠神经元,利用表达靶向神经连接蛋白3(NLGN3)分子shRNA的重组慢病毒(Lv-NLGN3-shRNA)感染神经元,real time RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NLGN3的表达,收集神经元培养上清与胶质瘤细胞系U251细胞共培养,Transwell实验检测U251细胞迁移能力,Western Blot方法检测U251细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果:Lv-NLGN3-shRNA重组慢病毒感染能够降低大鼠原代神经元中NLGN3 mRNA和蛋白的的表达,神经元培养上清与U251细胞共培养可以增加后者的迁移能力并上调mTOR和MMP-9的表达。然而,NLGN3表达被Lv-NLGN3-shRNA抑制后,培养上清对U251细胞促迁移能力下降,同时mTOR和MMP-9表达降低。结论:大鼠原代神经元可以通过NLGN3/mTOR/MMP-9信号通路增强U251细胞的迁移能力,这一途径可能是胶质瘤细胞转移的机制之一。