腺苷酸激酶4在脑缺血早期神经损伤中的作用研究

目的:脑供血不足导致的神经元损伤是缺血性脑卒中神经功能障碍的直接原因,线粒体功能异常与神经元损伤密切相关,腺苷酸激酶4(AK4)是能量代谢关键因子,本研究旨在探讨AK4在脑缺血早期神经损伤中的作用。方法:研究样本为60只雄性C57BL/6J小鼠,3~4周龄,体质量18~20 g,构建神经元特异性过表达AK4腺相关病毒(AAV)-空载(AAV-Ctrl组)以及AAV-AK4过表达(AAV-AK4组)小鼠。通过建立小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型模拟体内脑缺血,分别在缺血1 h、2 h和3 h后采用免疫印迹法测定AK4的蛋白表达水平;在单纯缺血3 h后,分别采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测缺血脑组织损伤程度,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)法检测神经元凋亡情况。结果:实验结果表明,MCAO 2 h和MCAO 3 h时梗死侧(I)相较于非梗死侧(NI)的AK4蛋白表达开始下调,其中MCAO 3 h最明显,差异均具有统计学意义(P <0.05)。与AAV-Ctrl组比较,MCAO 3 h后,AAV-AK4组小鼠的脑梗死体积明显缩小,且AAV-AK4组比AAV-Ctrl组小鼠的神经元凋亡数量明显减少,差异均具有统计学意义(P <0.05)。结论:脑缺血早期神经元过表达AK4可明显减少脑梗死体积,抑制神经元凋亡,发挥神经保护作用,AK4可能是缺血早期神经元损伤干预的新靶点。

非典型腺苷酸激酶AK6/hCINAP的结构和功能

腺苷酸激酶广泛存在于各种生物中,在维持细胞中核苷酸的正常含量以及能量代谢活动中发挥重要作用。腺苷酸激酶6 (AK6,又称人coilin相互作用核ATP酶蛋白hCINAP)是一种非典型的腺苷酸激酶,既具有腺苷酸激酶的活性,又具有ATP酶的活性。本课题组对AK6/hCINAP的结构、酶学特征和生物学功能开展了长期的研究,证明其在调控基因转录、核糖体质量、早期胚胎发育、细胞衰老、细胞代谢、细胞增殖和凋亡、DNA损伤反应、炎症反应、肿瘤发展等诸多生物学过程中均发挥关键作用。本文对AK6/hCINAP的结构特征、生物学功能及上游调控因子进行了总结,阐明该酶生物学作用和分子机制具有重要的生物学意义,有助于开发AK6/hCINAP选择性抑制剂并应用于临床治疗。

日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的将用表达序列标签(expression sequence tag, EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步研究该基因的功能做准备。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,用BLASTn程序搜索测序结果,根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后切下的SjAK基因导入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中。结果本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86%,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoR I及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AK cDNA高度同源,并且成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjAK。

猪带绦虫腺苷酸激酶的克隆及其重组蛋白免疫反应性的评价

为原核表达猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK),对其免疫性进行初步研究,本研究以猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中ADK同源基因重组质粒为模板,通过PCR扩增并将其亚克隆于原核表达载体pET28a(+),构建了pET-Ts-ADK重组质粒,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE鉴定,表明重组蛋白约30ku。经His-镍蛋白纯化柱纯化后western blot试验表明该重组蛋白可被猪带绦虫、亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明猪带绦虫ADK基因在原核表达系统中表达获得的蛋白具有免疫反应性。

大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆与表达分析

腺苷酸激酶(adenylate kinase,ADK)催化ATP+AMP 2ADP的可逆反应,是维持细胞能量动态平衡的关键酶,在植物中参与调节生长发育和逆境应答等过程。目前有关大豆ADK的研究还未见报道。本文通过RT-PCR方法,从耐盐大豆品种南农1138-2的叶中克隆到一个腺苷酸激酶基因,命名为GmADK。GmADK的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)长804 bp,编码267个氨基酸。预测其蛋白结构含有典型的腺苷酸激酶功能域ATP-AMP(Ap5A)结合位点和AMP结合位点。蛋白序列比对和进化树分析表明,大豆与菜豆(Phaseolus vulgaris)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的ADK序列相似性最高,亲缘关系最近。组织表达显示GmADK基因的表达量在大豆叶和根中高于茎中。荧光定量PCR分析表明GmADK的表达受盐胁迫的调节,且在耐盐(南农1138-2)和盐敏感(科丰1号)品种间存在差异。在叶和根中,200 mmol L–1NaCl处理6、12和24 h后,GmADK的表达量在盐敏感品种中比未处理对照有所降低,但在耐盐品种中却比未处理对照升高,因此推测GmADK可能参与大豆对盐胁迫的响应。

腺苷酸激酶4在肺腺癌中的表达及其临床意义

背景与目的:腺苷酸激酶(adenylate kinase 4,AK4)是一种调节腺嘌呤核苷酸代谢和体内稳态的关键调节酶。研究发现,AK4可促进肺癌细胞的侵袭与转移,并与肺癌患者预后不良密切相关,但AK4在肺腺癌发生、发展过程中的作用尚不清楚。研究AK4在肺腺癌中表达的变化,以及与患者临床病理学特征之间的关系,探讨AK4在肺腺癌发生、发展过程中的作用。方法:应用免疫组织化学EnVision法研究江苏省扬州市江都人民医院2017年1月—2019年12月胸外科手术切除的297例肺腺癌不同阶段病变,其中浸润性腺癌(invasive adenocarcinoma,IA)152例,微浸润性腺癌(microinvasive adenocarcinoma,MIA)52例,原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)60例,非典型腺瘤样增生(atypical adenomatous hyperplasia,AAH)33例,以及30例正常肺组织中AK4的表达。结果:AK4在AAH、AIS、MIA和IA中的表达率分别为63.6%、75.0%、71.1%和81.6%,均明显高于正常肺组织,差异有统计学意义(P<0.01),但AK4表达率在AAH、AIS、MIA和IA之间差异无统计学意义(P>0.05);AK4表达率在有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P<0.05),AK4高表达与肺腺癌pTNM分期密切相关(P<0.05)。AK4表达率与肺腺癌患者性别、年龄、吸烟状态、肿瘤部位及大小、脉管侵犯和胸膜侵犯无关(P>0.05)。结论:AK4不仅参与肺腺癌的早期发生,还参与肺腺癌的进展。AK4可望作为肺腺癌早期诊断和评估疾病进展的一种生物标志物。

蒙古族、朝鲜族和壮族中腺苷酸激酶、腺苷脱氨酶、血清触珠蛋白、α_1-抗胰蛋白酶的多态性

调查了中国内蒙古的蒙古族、吉林的朝鲜族和广西壮族的红细胞腺苷酸激酶(AK)、腺苷脱氨酶(ADA)及血清触珠蛋白(Hp)、a_1-抗胰蛋白酶(a_1-AT)的遗传多态性。蒙古族、朝鲜族、壮族的基因频率:AK_1~1分别为0.9843、1.0000、1.0000;ADA^1分别为0.9529、0.9468、0.9573;Hp^1分别为0.2597、0.3152、0.3571;在a_1-AT中Pi^M分别为0.9953、0.9953、0.9928,Pi^s分别为0.0000、0.0000、0.0072,Pi^F分别为0.0047、0.0047、0.0000。x^2检验表明,三个民族各项指标的表型观察值都符合Hardy-Weinberg法则。

胃癌组织中腺苷酸激酶4和HIF-1α的表达及其临床意义

目的观察胃癌组织中腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4,AK4)和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,探讨AK4和HIF-1α在胃癌发生、发展过程中的作用及其相关性。方法采用免疫组化EnVision法检测79例胃癌及其癌旁正常组织中AK4和HIF-1α蛋白表达,分析两者表达与胃癌临床病理特征之间的关系以及两者表达的相关性。结果胃癌组织中AK4和HIF-1α的高表达率分别为73.4%和69.6%,明显高于癌旁正常组织(25.3%和16.5%)(P<0.05)。AK4高表达与胃癌淋巴结转移、脉管侵犯和临床分期密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄、Lauren分型、分化程度及浸润深度无关(P>0.05);HIF-1α高表达与肿瘤Lauren分型、淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05),与患者性别、年龄、分化程度、浸润深度和脉管侵犯等无关(P>0.05)。胃癌组织中AK4和HIF-1α表达呈正相关(P<0.05)。结论AK4和HIF-1α协同作用参与了胃癌的发生、发展。AK4和HIF-1α联合检测可有助于预测胃癌的生物学行为。

肌肉浸润性膀胱癌中腺苷酸激酶4的表达及临床意义

目的探讨腺苷酸激酶4(AK4)在肌肉浸润性膀胱癌组织中的表达及其临床意义。方法回顾性分析2006年3月至2012年11月天津市第一中心医院接受膀胱癌根治手术治疗的85例肌肉浸润性膀胱癌患者的临床资料。采用免疫组织化学法检测85例膀胱癌组织和对应的癌旁组织中AK4的表达,分析其与临床病理学特征的关系。结果 AK4的阳性表达主要在细胞质内,呈棕黄色颗粒。AK4在膀胱癌组织中均有一定的阳性表达,而在癌旁组织中无表达。AK4的阳性高表达率为70.6%(60/85)。膀胱癌远处转移的AK4高表达率高于无远处转移者,有脉管内瘤栓的AK4高表达率高于无脉管内瘤栓者(P<0.05),不同性别、年龄、肿瘤分期和分级、淋巴结转移和复发的AK4高表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。生存分析提示,在膀胱癌中AK4高表达的患者生存时间明显短于低表达患者(P<0.05)。结论肌肉浸润性膀胱癌组织中存在AK4表达水平上调,并与膀胱癌远处转移和脉管内瘤栓有关,且AK4异常表达可能提示膀胱癌患者预后不良。

日本血吸虫一种新腺苷酸激酶全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签 (Expression Sequence Tag,EST)策略从日本血吸虫尾蚴 c DNA文库中筛选出的新基因进行功能预测。方法 用 NCBI站点的 BL ASTx及 BL ASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索 ;用 NCBI BLAST站点的 blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较 ;利用 Motif Scan in a Protein Sequence对 c DNA序列所编码的蛋白质进行结构域搜索 ;利用 CD-Search程序对目标蛋白进行保守区域搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫 2 2 k Da单核苷酸激酶 m RNA高度同源的日本血吸虫新基因 ,基因与氨基酸水平的同一性均分别为 86.0 %和 87.0 % ;蛋白结构域搜索及保守区域搜索结果显示 ,该 c DNA序列所编码的蛋白质是一种腺苷酸激酶。结论 用 EST策略筛选新基因是一个可行的方法 ,所筛到的日本血吸虫新基因编码一种腺苷酸激酶 ,全长编码序列与曼氏血吸虫腺苷酸激酶 m

胰腺导管腺癌中腺苷酸激酶4的表达及临床意义

目的:探讨腺苷酸激酶4(AK4)在胰腺导管腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:回顾性分析76例接受胰腺癌根治手术治疗的胰腺癌患者的临床与随访资料。采用免疫组织化学法检测76例胰腺癌组织和对应的癌旁组织中AK4的表达,分析其与临床病理学特征及预后的关系。结果:AK4的阳性表达主要在细胞浆内,呈棕黄色颗粒。AK4在胰腺癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为78.9%(60/76)和38.2%(29/76),前者表达率显著高于后者,差异有统计学意义(P<0.05)。AK4的异常表达与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓相关(P<0.05)。生存分析提示在胰腺导管腺癌中AK4高表达的患者生存时间明显短于低表达的患者(P<0.05)。结论:胰腺导管腺癌组织中存在AK4表达水平的上调,AK4的表达可能提示胰腺癌患者分期较晚和预后不良。

人类腺苷酸激酶家族中几个新亚型及其功能特点

腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)是一种催化磷酸基团在腺嘌呤核苷酸之间相互转换,从而调节细胞内的不同部分腺嘌呤核苷酸比例的磷酸转移酶。近年来,越来越多的腺苷酸激酶同工酶新亚型被发现,现从编码腺苷酸激酶基因的定位、腺苷酸激酶的底物偏好及其功能等几个方面做了综述,为全面深入了解腺苷酸激酶家族提供了良好的理论基础和新线索。

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kinase,AK)基因真核表达载体并予以鉴定。方法根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1(+),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性。结果经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段。结论成功地构建了基因真核表达载体。

马铃薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及其植物表达载体的构建

目的:克隆马铃薯腺苷酸激酶基因(adk)并进行生物信息学分析,构建反义表达载体。方法:用RT-PCR方法从西南地区马铃薯主推品种“米拉”中克隆adk编码序列,进行生物信息学分析后,反向插入植物高效表达载体pCAMBIA1304+,构建其反义植物表达载体。结果:克隆到的adk编码序列(stadk)为867bp,编码由288个氨基酸残基构成的多肽。生物信息学分析表明,其亚细胞结构定位于质体,具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ATP-AMP(Ap5A)结合位点和AMP结合位点,蛋白质三维模型具有典型的ADK蛋白立体结构。该蛋白与另一条来源于马铃薯的ADK2序列的遗传相似性最高,在进化树上与杏、苜蓿、水稻的距离最近,与拟南芥的距离最远。将构建好的反义表达载体pCAMBIA1304+-Astadk导入根癌农杆菌菌株LBA4404,获得了工程菌菌株。结论:克隆到stadk基因。生物信息学分析表明,在淀粉合成水平最高的植物中,腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高。获得的工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,为实现淀粉代谢工程奠定了基础。

云南23个少数民族人群腺苷酸激酶(AK_1)多态分布调查

采用淀粉凝胶电泳法，对云南彝、白、哈尼、壮、傣、苗、傈僳、回、拉祜、佤、纳西、瑶、藏、景颇、布朗、普米、怒、阿昌、德昂、基诺、布依、独龙和苦聪人等23个少数民族人群的红细胞腺苷酸激酶（AK1）的多态分布进行了调查、结果，在23个人群中均未检出AK12纯合子。但在彝、回、景颇、布朗、怒和德昂6个民族中检出了杂合子，基因频率在这6个民族中的分布在0．0045－0．0446之间，其中，仅回族的AK12基因达多态水平。

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因的克隆及序列分析

目的-克隆阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶 (AK) 基因, 并测定其序列, 进行序列分析。方法-根据AK基因已知序列设计合成一对引物, 应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因, 并将其克隆入pMD18 T simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后, 用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。结果-PCR扩增得到特异的阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的PT AK重组质粒。测序表明, 所克隆的AK基因大小为690 bp, 编码229个氨基酸。序列分析表明, 所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性 (99 9%)。结论-克隆了阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因, 序列测定及同源性分析表明, 所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性。

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。 方法 将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。 结果 重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。 结论 AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 。

大鼠烫伤早期肝线粒体ATP合成酶和腺苷酸激酶活性的改变

为进一步了解大鼠烫伤早期肝线粒体氧化磷酸化偶联增强的机理，应用荧光素和荧光素酶法，以琥珀酸为底物，测定了烫伤３０ｍｉｎ大鼠肝线粒体合成酶和腺苷酸激酶的活性，发现该两种酶的活性与假处理组相比均增高。提示这两种酶活性增高可能与烫伤早期ＡＴＰ形成率增高和氧化磷酸化偶联增强有关。

桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因的克隆和序列分析

腺苷酸激酶是广泛存在的一种重要的核苷酸激酶。进行PCR扩增和克隆测序获得桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因长502 bp的序列,NCBI在线BLAST分析其与大肠杆菌、流感嗜血杆菌同源基因的相似性在80%以上,序列编码蛋白有腺苷酸激酶保守的AMP结合结构域和LID结构域,为长型腺苷酸激酶。聚类分析结果表明,该基因与其他细菌的同源基因聚合在同一分支。

广东粤西地区汉族人群红细胞酸性磷酸酶-腺苷脱氨酶-腺苷酸激酶的遗传学特性

目的:应用红细胞酸性磷酸酶-腺苷脱氨酶-腺苷酸激酶同步电泳分型,从血型遗传学角度对粤西汉族血液中3种酶型的表型分布、基目频率进行调查。方法:实验于2005-03/11在湛江师范学院完成。①血样取自广东湛江地区无血缘关系的汉族健康成人120例,3代内无与外族通婚史。②120例汉族健康成人均取耳血一两滴,渗于无菌纱布上,血痕直径1cm,低温干燥保存,7～14d内进行血痕表型检测。③基因频率计算采用Hardy-Weinbery平衡计算法。种群中某基因频率(%)=种群中该基因总数/种群中该对等位基因总数×100%;种群中某基因型频率(%)=种群中该基因型个体数/该种群的个体数×100%。结果:实验血样取自广东湛江地区无血缘关系的汉族健康成人120例,全部进入结果分析。①粤西汉族酸性磷酸酶、腺苷脱氨酶、腺苷酸激酶3种酶型表现型的观察值与期望值基本吻合(P>0.05),检测的酶型中未发现稀有型、变异型,亦未发现罕见基因。②在粤西汉族群体中,酸性磷酸酶具有中高鉴别能力(积累能力值0.5043),腺苷脱氨酶为低鉴别能力(积累能力值0.2922),而腺苷酸激酶无鉴别能力(积累能力值0.0023)。结论:粤西汉族人群3种检测酶型中未发现稀有型、变异型,亦未发现罕见基因。符合Hardy-Weinbery遗传平衡定律。