鸡腺苷琥珀酸裂解酶互作蛋白的筛选及其功能分析

通过探究鸡腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase)基因ADSL与其互作基因的调控关系,为进一步研究ADSL在肌肉中高表达的原因和ADSL影响肌肉风味的机制提供参考。本研究构建了鸡(gallus)ADSL基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-ADSL,将pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1质粒分别转染鸡成肌细胞,提取表达成功的细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)联合质谱分析鉴定与鸡ADSL蛋白互作的细胞蛋白,并对结果进行GO功能注释、KEGG通路和蛋白互作网络分析。通过分析筛选出RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10蛋白,检测在ADSL基因过表达和沉默状态下,RPL 4、PDLIM 5、ACTG 1和SRSF 10基因在成肌细胞中的表达情况。结果表明,与ADSL互作的蛋白共94个;生物信息学分析表明,这些蛋白定位于细胞结构体、胞内和含蛋白质的复合物上,它们主要参与细胞进程、生物调节和刺激反应等生物进程。间接免疫荧光结果显示,重组蛋白pEGFP-C1-ADSL主要定位于细胞核和细胞质。ADSL过表达时,成肌细胞内RPL 4基因和PDLIM 5基因的表达下调,ACTG 1和SRSF 10基因的表达上调;当ADSL被沉默后,成肌细胞内RPL 4和ACTG 1基因的表达上调。研究结果丰富了调控风味的ADSL蛋白,为进一步了解ADSL的功能及该基因在肌肉中高表达提供了参考。

寿光鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶ADSL基因的表达与克隆化细胞株的筛选

利用RT-PCR与RACE方法检测寿光鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌8种组织腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）基因mRNA的差异表达水平，构建ADSL基因融合表达载体pGEX-ADSL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆，IPTG诱导表达，通过构建真核表达载体pEGFP-ADSL，利用脂质体介导法转染寿光鸡成纤维细胞，并进行阳性细胞的克隆化筛选与检测。结果表明：ADSL基因开放阅读框序列长为1455 bp，编码485个氨基酸;5′端非转录调控区具有典型管家基因的特征，在邻近起始密码子-28 bp处发生C→T突变，该突变使该位点变为核呼吸因子2（NRF-2）结合位点;经SDS-PAGE电泳显示，pGEX-ADSL重组融合蛋白在分子量约为80.5 ku处有特异的蛋白条带出现，与预期分子量大小一致，等电点为6.79，纯化后用Western-blot检测为寿光鸡ADSL蛋白。pEGFP-ADSL转染寿光鸡成纤维靶细胞后24、48和72 h，转染率在26.4%~41.2%之间，绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中，随表达量的增加，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状，经药物筛选和克隆化培养，获得表达pEGFP-ADSL融合蛋白的阳性克隆细胞株，经RT-PCR扩增与Western-blot检测确认ADSL融合蛋白基因已经整合到寿光鸡成纤维细胞的基因组中，获得正常表达。研究结果为揭示我国优良地方鸡种的风味基因结构，研究其生物学功能奠定基础。

产褐藻胶裂解酶菌株S10的鉴定、全基因组测序及分析

为了详细解析从仿刺参肠道中分离出1株具有较高酶活力高产褐藻胶裂解酶菌株S10的基因组序列信息,进而深入挖掘与褐藻胶裂解酶相关的基因资源,本研究通过形态学观察和16S rRNA序列分析对菌株S10进行菌种鉴定,然后利用Illumina二代测序技术和第三代高通量PacBio测序平台对菌株S10进行全基因组测序,并使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测及基因功能注释等。此外,根据注释结果对菌株S10中所含的3组假定褐藻胶裂解酶基因序列进行生物信息学分析及结构预测。结果表明,菌株S10被鉴定为Vibrio alginolyticus,基因组总长度为5397046 bp,GC含量为44.59%,由2条染色体和1条质粒组成。预测共有4936个编码基因,127个tRNA基因和37个rRNA基因。在直系同源集、基因本体论、京都基因与基因组百科全书和碳水化合物活性酶数据库中分别注释到4039、3163、3104个和96个功能基因。此外,在菌株S10中发现了3组潜在的褐藻胶裂解酶基因alg4755、alg4756和alg4760。生物信息学分析结果表明,褐藻胶裂解酶Alg4755、Alg4756和Alg4760均属于多糖裂解酶家族7(polysaccharide lyases,PL7)蛋白,具有3个PL7家族高度保守的基序(R*E*R、Q(I/V)H、Y*KAG*Y*Q)。综上,S10菌株全基因组测序及分析对该菌的高效产酶机制研究和新型褐藻胶裂解酶的挖掘具有重要意义,可为后期酶的表达及工业化应用提供理论基础。

辣椒果胶裂解酶基因家族的生物信息学分析

为了解辣椒果胶裂解酶(Pectin lyase like,PLL)基因家族成员数量、理化结构及可能参与的生物学过程,以期为全面鉴定和认识辣椒CaPLLs基因家族的生物学功能提供研究基础。利用全基因组扫描方法和在线生物信息学工具对辣椒CaPLLs基因家族进行了鉴定和分析。结果在辣椒参考基因组的9条染色体上共鉴定出28个CaPLLs基因家族成员,且分别隶属于5个亚族;CaPLLs家族成员的氨基酸序列长度介于183~762 aa,分子量范围为19.65~84.31 kDa,等电点范围为5.39~9.44。保守基序及结构域分析表明,CaPLLs家族成员共有10个保守基序,所有成员均含有Pec_lyase_C结构域。有多种与激素、胁迫应答和生长发育相关的顺式作用元件存在于CaPLLs基因的启动子区域中。由此可见,这28个CaPLLs基因家族成员同一亚家族基因之间高度保守。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶(Adsl)基因多态性及其与肌苷酸含量相关研究

腺苷琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一,催化嘌呤核苷酸合成过程中的两个重要反应:(1)由SAC IAR生成AICAR的反应;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。本研究对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因的cDNA进行了克隆,并对序列进行了分析,共发现有6处碱基突变:249G→A(TH),717 C→G(TH),985 A→G(TH)仅在泰和乌骨鸡中出现;992 T→C(RW),1400 C→T(RW)仅在隐性白羽肉鸡中出现;而在泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡中均检测到突变1179 A→C(TH,RW)。其中985 A→G(TH),1400 C→T(RW)处突变导致两处氨基酸突变:Thr→A la(305),A la→Val(443),其它4处碱基突变均为同义突变。

5个鸡种腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因外显子9 SNP及其与鸡肉肌苷酸含量的相关分析

根据腺苷琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子9的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现9 839位碱基发生了突变,由C突变为A,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,发现突变后引起ADSL基因第273位氨基酸由Pro突变为Thr,为错义突变。经独立性检验,发现基因型频率和基因频率分布与品种有关,但进一步方差分析并没有显示出该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间存在关联。

家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系

根据腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)基因外显子2的序列设计引物,用PCR-SSCP的方法对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、白耳鸡、藏鸡以及红色原鸡两个亚种进行了单核苷酸多态性分析,并检测到了多态性,表现为3种基因型,对两种纯合子进行直接测序,结果发现3484位碱基处发生C→T突变。对3种基因型的肌肉肌苷酸含量的最小二乘分析结果显示TT型(突变型)个体的肌肉肌苷酸含量极显著地高于CT型、显著地高于CC型个体,CT型个体也稍高于CC型,但差异不显著,初步推测该位点可能与肌肉肌苷酸含量有关。根据该多态位点的基因频率,基于Nei氏的遗传距离运用NJ聚类法构建系统发生树,进行家鸡与原鸡的亲缘关系分析,结果发现,丝羽乌骨鸡与白耳鸡的亲缘关系最近,藏鸡和中国红原鸡亚种的亲缘关系也较近,中国地方家鸡品种与中国红原鸡亚种的亲缘关系较近,而与泰国红色原鸡的亲缘关系较远,隐性白羽鸡与原鸡亲缘关系最远,初步得出中国家鸡有自己独自的血缘来源的结论。

草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶克隆及序列分析

腺苷酸基琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶。研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库为基础,应用PCR、RT-PCR和RACE技术,成功获得了草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的cDNA全长和基因组DNA全长。该基因全长1584 bp,包含一个1449 bp的开放阅读框,编码482个氨基酸,与其他脊椎动物比对显示,其序列具有较高的保守性。草鱼腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因组DNA由13个外显子和12个内含子组成,其外显子拼接位点非常保守,遵循GT-AG原则。

几种离子对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性和最适pH值的影响

在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ８．０的１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，当离子浓度＜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｋ＋和Ｎａ＋离子是豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的激活剂，其最适浓度约为７５ｍｍｏｌ／Ｌ，可分别提高酶活性４０％和３５％。Ｍｇ２＋离子是ＡＳＡＬ的抑制剂，能拮抗Ｋ＋和Ｎａ＋离子的激活效应。ＨＰＯ二４离子可显著降低酶活性，抑制效应与ＨＰＯ二４离子浓度呈正相关。在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ６．６～８．０的１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为７．４，而在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ７．４～８．６的Ｔｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为８．２。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因适用性进化分析

采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以肝脏总RNA为模板,对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)编码区序列进行克隆和测序;并结合Gen-Bank中已提交的家鸡、鱼类、哺乳动物和人类等ADSL基因序列,采用基于最大似然法的密码子置换模型分析ADSL基因编码区序列在进化过程中承受的选择压力。结果RT-PCR方法准确获得了泰和乌骨鸡和隐性白羽肉鸡ADSL基因编码区序列,全长为1 380bp。"分支特异模型"检验结果表明,ADSL基因在不同物种进化过程中较为保守,未受到正选择作用。鸡ADSL基因序列的"位点特异模型"检验未发现正选择位点。研究结果有助于了解鸡ADSL基因的结构及进化历程。

甘油对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性的影响

】在缓冲液中添加１５％（Ｖ／Ｖ）甘油可使腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的活性提高２４％，对防止ＡＳＡＬ变性失活的效果显著。在４℃静置８，２３和５２ｈ后，ＡＳＡＬ活性分别为原活性的９３％，７４％和６４％，而不加甘油的对照，ＡＳＡＬ活性仅分别为原活性的３０％，３％和０。

3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床特点及基因变异分析

目的了解3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的临床特点及基因变异情况。方法分析6例3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症患儿的临床资料及基因检测结果。结果6例患儿,男性3例,女性3例。1例家族史阳性。3例患儿当地医院行新生儿筛查提示该疾病,2例患儿为发病后临床诊断,1例患儿至今未发病。5例患儿发病年龄10天~5岁。初诊年龄为1个月~7岁,发病时均有不同程度的代谢危象、低血糖和高乳酸血症等表现。2例患儿死亡。血串联质谱显示3-羟基异戊酰肉碱升高,部分患儿伴有己二酰肉碱升高;尿有机酸分析提示3-羟基-3-甲基戊二酸显著升高,伴3-甲基戊烯二酸、3-羟基异戊酸等增高。4例患儿基因检测均发现HMGCL基因变异:2例c.122G>A(p.R41Q)纯合;1例c.697C>T(p.H233Y)纯合;1例c.145-2A>G和c.590G>A(p.C197Y)复合杂合。其中,c.697C>T(p.H 233Y)、c.145-2A>G和c.590G>A(p.C 197Y)变异均为首次报道,蛋白结构预测均为可能有害,ACMG评级为可能致病。另2例患儿未行基因检测。结论3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床表型多样,结合血串联质谱、尿有机酸分析及基因诊断可确诊。对3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的筛查有助于早期确诊及合理治疗。

精氨琥珀酸裂解酶及合成酶在人胃癌组织中表达的意义

目的探讨精氨琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨琥珀酸合成酶(ASS)mRNA在人胃癌组织中的表达。方法收集胃癌组织15例及相应癌旁正常组织12例,采用RT-PCR方法分别检测其中ASL及ASSmRNA的表达,了解胃癌组织与癌旁正常组织中可能存在的ASS及ASL表达差异。结果胃癌组织中ASSmRNA的表达低于正常组织,具有统计学差异(P<0.05);但ASL的表达与正常组织相比无显著性差异。结论胃癌组织中ASSmRNA表达水平下降,提示了精氨酸耗竭原理用于胃癌治疗的可行性。

细脚拟青霉腺苷酸琥珀酸合酶基因的克隆与表达分析

腺苷酸琥珀酸合酶(ADSS)为细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes)有效成分腺苷合成代谢途径的关键酶,而细脚拟青霉中腺苷酸琥珀酸合酶基因Ptadss的克隆与序列分析鲜见相关报道。本文在细脚拟青霉转录组测序结果的基础上,利用PCR技术克隆得到该菌Ptadss基因的cDNA序列,对Ptadss基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析(相关理化性质、结构域、亲水性-疏水性、亚细胞定位、信号肽和高级结构等),并构建PtADSS与相关微生物ADSS的系统进化树。同时,采用实时荧光定量PCR技术,分析Ptadss基因在不同发酵阶段的细脚拟青霉菌丝体中的表达量,以初步明确该基因的表达量对于细脚拟青霉腺苷含量的影响。结果表明:克隆得到的Ptadss基因的ORF序列为1 670bp。该基因编码的蛋白的基本性质为:423个氨基酸残基、相对分子量为46.7 663kDa、等电点(pI)为5.59,含58个磷酸化位点,且该蛋白为定位于细胞质中的非分泌性和非跨膜的疏水性蛋白。结构预测结果表明该蛋白是由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成的复杂结构。序列分析结果提示,细脚拟青霉Ptadss基因与Cordyceps confragosa腺苷酸琥珀酸合酶基因同源性最高,可达91%。结合其他微生物的ADSS氨基酸序列构建系统树,结果表明细脚拟青霉与Cordyceps confragosa亲缘关系较近。另经对不同发酵阶段的细脚拟青霉中Ptadss的表达量及腺苷含量分析结果表明:Ptadss基因的表达水平与菌丝体中腺苷含量存在正相关性。

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的 了解精氨琥珀酸裂解酶 (ASL)与乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原启动子 Ⅰ (SpⅠ )的关系 ,研究精氨琥珀酸裂解酶与SPI在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T A克隆法 ,将ASL基因片段连入载体pGEM T。将获得的质粒pGEM T ASL ,与报告质粒pcDNA3 .1(-)分别用KpnI和XhoI双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3 .1(-) ASL ,将重组表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpⅠ瞬时转染HepG2细胞 ,同时转染pCAT3 basic入HepG2细胞 ,作为阴性对照 ,48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性 ,以了解ASL对SpI转录活性的调节作用。结果 构建的真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpI共转染的HepG2细胞中 ,CAT表达活性是CAT3空载体的 3 .3倍 ,是pCAT3 SpⅠ的1.45倍。结论 精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性 ,促进表面抗原基因的表达。

肝病患者精氨酸代琥珀酸裂解酶分泌及与肝病相关血清学指标的关系

目的探讨肝脏疾病时精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)分泌及与肝病相关血清学指标的关系。方法随机选择102例明确诊断的肝病患者,测定血清ASL、甘氨酸胆酸(GCA)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST),与71例非肝病患者以及40例健康体检者(健康对照组)进行对照比较。结果肝病组血清ASL水平显著高于非肝病组和健康对照组(均P<0.01),而非肝病组和健康对照组间差异无统计学意义;GCA、ALT和AST三组间差异有统计学意义(均P<0.01)。受试者工作特征曲线(ROC Curve)显示ASL诊断肝病疾病的诊断效率高于GCA、ALT和AST,相关性分析显示肝病患者血清ASL水平与GCA、ALT、AST呈正相关性(r=0.618,P<0.01;r=0.473,P<0.01;r=0.433,P<0.01)。结论 ASL是反映肝脏疾病的灵敏指标,与常见的肝病血清学诊断指标有关联性,且诊断效率最高,适合临床开展。

高肺血流量对肺血管结构及胱硫醚-γ-裂解酶基因表达的影响

目的 :探讨高肺血流量所致肺动脉高压大鼠肺血管结构和内源性硫化氢体系的变化。方法 :SD大鼠共1 6只 ,随机分为分流组及对照组。对分流组大鼠行腹主动脉 -下腔静脉分流术。 1 1周后以右心导管法测定肺动脉平均压 (pulmonaryarterymeanpressure ,mPAP)。检测右心室 /体重 (rightventricle/bodyweight,RV/BW )和右心室 /左心室 +室间隔 (rightventricle /leftventricleplusseptum ,RV/LV +S)比值。并且以光学显微镜和电子显微镜观测肺血管结构的变化。以分光光度法测定血浆硫化氢 (hydrogensulfide,H2 S)含量。化学法测定肺组织硫化氢产出率 ,以原位杂交的方法检测肺动脉胱硫醚 γ 裂解酶 (cystuthionine γ lyase ,CSE)mRNA表达。 结果 :分流组大鼠mPAP、RV/BW及RV/ (LV +S)比值明显高于对照组 ,光镜下肺小血管肌化程度明显增强 ,肺中、小肌型动脉相对中膜厚度明显增加。电镜下 ,肺中、小肌型动脉内皮细胞增生、肥厚、肿胀 ,平滑肌细胞增生、肥厚 ,并由收缩表型向合成表型转化。分流组大鼠的血浆H2 S含量及肺组织CSE活性 (肺组织H2 S产出率 )明显低于对照组 ,肺动脉mRNA表达明显降低。结论 :肺血管结构重建是高肺血流量所致肺动脉高压的重要病理基础 ,内源性H2 S体系———mRNA表达、CSE活性及血浆H2

苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl4的致病功能研究

【目的】通过研究苹果树腐烂病菌果胶裂解酶(pectate lyase,PL)基因Vmpl4敲除突变体的致病力、对果胶的利用和基因敲除后家族内其他基因的表达水平变化,探明Vmpl4在致病过程中的作用。【方法】采用q RT-PCR技术检测Vmpl4在野生菌株03-8与寄主互作过程中的表达水平及Vmpl4敲除后PL家族内其他基因的表达水平,通过Doublejoint PCR构建基因敲除载体,并通过PEG介导原生质体遗传转化获取转化子、PCR及Southern blot验证基因敲除突变体。利用苹果叶片和枝条离体接种方法检测突变体致病力;接种至PDA及果胶培养基,观察突变体的营养生长和对果胶的利用情况。【结果】Vmpl4在病菌侵染过程中上调表达高达10.20倍;通过验证得到1个基因敲除突变体,其在叶片和枝条上的致病力均显著降低,在果胶培养基上生长速率也明显降低,Vmpl4敲除后家族内4个基因在病菌侵染过程中表达水平显著上调。【结论】果胶裂解酶基因Vmpl4通过降解果胶参与致病过程,PL家族内其他基因与Vmpl4在病菌致病性方面共同发挥作用。

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43'中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。

碱性果胶酯裂解酶基因工程菌Pichia pastoris诱导表达条件初步优化

在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对影响碱性果胶酯基因工程菌Pichia pastoris表达的主要因素进行研究,确定初始甲醇浓度、甲醇补加量和氮源酵母氮基(YNB)浓度3个主要影响因素的初步优化结果为5%、0.8%和1.3%.在此基础上,利用响应面分析法进一步优化.经优化,表达条件为初始甲醇浓度4.35%、甲醇补加量0.75%以及YNB浓度1.31%,优化后碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到40.6U/mL,较初始培养条件提高约2.3倍.同时,利用SDS-PAGE电泳对优化前后基因工程菌表达情况进行分析,结果同样表明胞外目标蛋白PL表达量有明显增加,进一步证实条件优化后对目标蛋白PL分泌表达具有十分明显的促进作用.