结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究

目的 描绘结核分枝杆菌膜囊泡(mycobacterium tuberculosis membrane vesicles,MVs)的RNA特征表达谱,分析其主要的生物功能,初步探索其诱导巨噬细胞凋亡的作用。方法 分离结核分枝杆菌MVs,提取总RNA,采用illumina Hiseq 2500-SE50平台进行双端测序。使用BWA软件进行序列比对,通过COG数据库对基因进行功能注释。通过MTT试验检测细胞存活率,采用Annexin-V联合PI染色法检测细胞凋亡。结果 本研究通过RNA测序及生物信息学分析描绘了结核分枝杆菌MVs中RNA的种类及含量,COG数据库功能注释结果显示这些RNA主要富集的生物学功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。生物分析显示富集的主要功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。功能实验表明,结核分枝杆菌MVs可以降低THP-1源巨噬细胞的存活率,促进细胞凋亡。结论 结核分枝杆菌MVs中含有丰富的短片段RNA,具有诱发细胞凋亡的作用。然而其具体作用机制仍需要更深入细致的研究。

结核分枝杆菌膜囊泡的分离及其对细胞因子释放的作用

目的分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡，检测其形态和粒径分布，初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用。方法采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv，通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期，菌体全部接种于苏通培养基中继续培养3周，离心取上清，超滤浓缩结合超速离心分离提取结核分枝杆菌H37Rv膜囊泡，通过透射电镜观察膜囊泡的大小、形态，采用纳米颗粒跟踪仪分析膜囊泡的粒径及分布。同时，设置不处理对照组、H37Rv感染组[按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）=20：1]和H37Rv膜囊泡处理组（按照膜囊泡：细胞=100：1）处理佛波酯（50ng／ml）诱导贴壁的单核巨噬细胞（THP-1）4h，更换新鲜培养基后0h、4h、8h、24h收集细胞培养上清，采用Milliplex多细胞因子检测试剂盒检测细胞因子的释放情况，通过曼-惠特尼U（Mann-WhitneyU）检验对各时间点H37Rv膜囊泡处理组和不处理对照组之间肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）释放量进行比较，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果按照调整后的提取方法得到的提取物中可检测到H37Rv分泌的膜囊泡，平均粒径为137nm，主要分布在30～510nm之间，〈250nm的膜囊泡数量占总量的96．88％。4h、8h和24h的TNF-α、ID6和IL-1β释放量与不处理对照组[分别为348．19（333．99，360．47）pg／ml、412．38（406．67，418．79）pg／ml、324．44（316．11，331．14）pg／ml；3．01（2．81，3．02）pg／ml、5．40（5．26，5．83）pg／ml、13．22（11．80，13．77）pg／ml；118．92（113．97，122．47）pg／ml、132．33（125．87，137．62）pg／ml、169．31（167．75，172．49）pg／ml]相比，H37Rv膜囊泡处理组[分别为507．33（501．80，513．84）pg／ml、4483．00（4130．75，4522．50）pg／ml、8170．00（8058．25，8206．75）pg／ml；12．88（12．04，13．84）pg／ml、68．51（66．88，69．77）pg／ml、335．44（331．02，340．64）pg／ml；800．57（791．18，809．60）pg／ml、1559．00（1546．00，1566．00）pg／ml、4316．50（4094．75，4389．75）pg／ml]均明显增加，差异均有统计学意义（u值均〈0．001，P值均〈0．01）；但4h、8h和24h的ID-10释放量[不处理对照组分别为1．23（1．21，1．31）pg／ml、1.56（1．31，1．82）pg／ml、5．41（4．99，5．89）pg／ml；H37Rv膜囊泡处理组分别为4．56（4．49，4．82）pg／ml、1．43（1．28，1．89）pg／ml、1．56（1．48，1．68）pg／ml]差异均无统计学意义（U值分别为6．00、17.00、7．00，P值分别为0．065、0．898和0．087）。结论本研究建立了结核分枝杆菌膜囊泡分离提取的技术流程，可以得到纯度较好、形态完整、粒径正常的膜囊泡。同时，结核分枝杆菌膜囊泡可以诱发巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。

细菌膜囊泡在海洋生态系统中的研究现状及展望

膜囊泡是一类由细菌释放并携带复杂蛋白质、核酸、信号分子等重要信息物质的生物纳米颗粒,参与了水平基因转移、群体感应、生物膜形成等多种生理生化活动。海洋中的细胞膜囊泡可能是除噬菌体和细菌之外的第三大生物实体,其介导的跨越物种的细胞间通讯对海洋生态系统而言有重要意义。然而,我们对膜囊泡在海洋生物圈中具体的生态角色与生物功能所知甚少。因此,本综述从细菌膜囊泡在海洋微生态、海洋共生体系中的作用及其物质流转对生态系统的影响等方面开展讨论,分析了目前细菌膜囊泡在海洋生态功能研究中尚未解决的科学问题,并对未来的研究方向进行了展望。

Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合特性

【目的】营养期杀虫蛋白Vip3A是一种由苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生的新型杀虫毒素。Vip3A与敏感昆虫中肠上皮细胞的结合是其发挥杀虫活性的关键步骤。为进一步探究Vip3A毒素的杀虫机理,研究Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡(BBMVs)的结合特性。【方法】在大肠杆菌中用IPTG诱导表达Vip3Aa10,用亲和层析和离子交换层析的方法纯化蛋白,并用胰蛋白酶活化Vip3Aa10,得到Vip3Aa10-T。然后分析Vip3Aa10前毒素和Vip3Aa10-T对甜菜夜蛾的杀虫活性,用免疫印迹法和配体印迹法分析Vip3Aa10-T与甜菜夜蛾BBMVs的结合特性以及在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白。【结果】Vip3Aa10-T与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾的杀虫活性很高。Vip3Aa10-T在pH8.0时更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合,并且能够与非敏感性昆虫黄粉虫BBMVs结合。在相同pH条件下,Vip3Aa10前毒素比Vip3Aa10-T更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合。Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMVs上有4条结合蛋白,其分子量分别为80、38、31和22kDa。【结论】活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs的结合是pH依赖性的,并且能与BBMVs上的4个蛋白结合。

结核分枝杆菌膜囊泡的分离及其对细胞因子释放的作用

目的分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡，检测其形态和粒径分布，初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用。方法采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv，通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期，菌体全部接种于苏通培养基中继续培养3周，离心取上清，超滤浓缩结合超速离心分离提取结核分枝杆菌H37Rv膜囊泡，通过透射电镜观察膜囊泡的大小、形态，采用纳米颗粒跟踪仪分析膜囊泡的粒径及分布。同时，设置不处理对照组、H37Rv感染组[按照感染复数（ multiplcty ofinfection, MOI ）=20：1]和H37Rv膜囊泡处理组（按照膜囊泡=细胞=100：1）处理佛波酯（50mg/ml）诱导贴壁的单核巨噬细胞（THP-1）4h，更换新鲜培养基后0h、4h、8h、24h收集细胞培养上清，采用Milliples多细胞因子检测试剂盒检测细胞因子的释放情况，通过曼-惠特尼U（mann-Whimey U）检验对各时间点H37Rv膜囊泡处理组和不处理对照组之间肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）释放量进行比较，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果按照调整后的提取方法得到的提取物中可检测到H37RV分泌的膜囊泡，平均粒径为137nm，主要分布在30—510nm之间，〈250nm的膜囊泡数量占总量的96．88％。4h、8h和24h的TNF-α、IL-6和IL-1β释放量与不处理对照组[分别为348．19（333．99，360．47）pg/ml、412．38（406．67，418．79）pg/ml、324．44（316．11，331．14）pg/ml；3．01（2．81，302）pg/ml、5．40（5．26，5．83）pg／ml、13．22（11．80，13．77）pg／ml；118．92（113．97，122．47）pg/m、132．33（125．87，137．62）pg/m、169-31（167．75，172．49）pg／ml]相比，H37Rv膜囊泡处理组[分别为507．33（501．80，513．84）pg/ml、4483．00（4130．75，4522．50）pg/ml、8170．00（8058．25，8206．75）pg／ml；12．88（12．04，13．84）pg／ml、68．51（66．88，69．77）pg／ml、335．44（33102，340．64）pg/ml；800．57（791．18，809．60）pg／m1、1559．00（1546．00，1566．00）pg/ml、4316．50（4094．75，4389．75）pg/ml]均明显增加，差异均有统计学意义（U值均〈0．001，P值均〈0．01）；但4h、8h和24h的IL-10释放量[不处理对照组分别为1．23（1．21，1131）pg/ml、1．56（1.31，1．82）pg／ml、5．41（4．99，5．89）pg／ml；H37RV膜囊泡处理组分别为4．56449，4．82）pg／ml、1.43（1．28，1．89）pg/ml、1．56（1．48，1．68）pg/ml]差异均无统计学意义（u值分别为6．00、17．00、7．00，P值分别为0．065、0．898和0．087）。结论本研究建立了结核分枝杆菌膜囊泡分离提取的技术流程，可以得到纯度较好、形态完整、粒径正常的膜囊泡。同时，结核分枝杆菌膜囊泡可以诱发巨噬细胞中细胞因子TNF—α、IL-6和IL—β的释放。

CrylA毒素与二化螟中肠刷状缘膜囊泡受体蛋白配基结合分析

分离和鉴定二化螟Chilo suppresalis幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)中Cryl A毒素的受体蛋白,对于阐明Cryl A毒素作用机理和二化螟抗性机理具有十分重要的意义。为此,本文就Cryl A毒素对二化螟杀虫活性及Cryl Ac与二化螟中肠受体的配基结合进行了研究。结果表明:Cryl Ab对二化螟室内品系(CN)的毒力高于Cryl Ac,而Cryl Ac高于Cryl Aa。配基结合分析表明二化螟CN品系幼虫中肠BBMV中有6个Cryl Ac结合蛋白(分子量分别为50,70,90, 120,160和180 kDa),其中180,160和90 kDa结合蛋白的条带颜色明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白具有较高的结合浓度。同源竞争结合研究表明,180和90 kDa结合蛋白为Cryl Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cryl Ac和Cryl Ab受体结合部位的相互作用,进行了异源竞争结合研究。Cryl Ab可以与Cryl Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,与180,120,70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性。结果显示,Cryl Ac与Cryl Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上拥有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合性有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cryl Ac和Cryl Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。

杠柳新苷类化合物对东方黏虫的杀虫活性及对中肠细胞刷状缘膜囊泡3种特征酶活性的影响

为了研究和阐明杠柳新苷类杀虫活性化合物对东方黏虫的杀虫活性及作用靶标,采用载毒叶片饲喂法测定比较了6个杠柳新苷类化合物(PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST)对3龄东方黏虫Mythimna separata Walker幼虫的毒力;应用MgCl_(2)沉淀差速离心法制备东方黏虫中肠细胞刷状缘膜囊泡(BBMV)基础上,测定了6个化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV中3种特征酶——氨肽酶、碱性磷酸酶及V-ATP酶活性的影响。结果表明:杠柳新苷P(PSP)和T(PST)对3龄东方黏虫幼虫表现出较高的杀虫活性,其24 h的致死中浓度(LC_(50)值)分别为1.60和1.23 mg/mL,杠柳新苷A(PSA)、D(PSD)和F(PSF)仅表现出微弱的杀虫活性(LC_(50)>20 mg/mL),而杠柳新苷E(PSE)则无明显杀虫活性。酶活性测定结果表明,6个杠柳新苷类化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶活性均没有明显的抑制作用,而高杀虫活性化合物PSP和PST则可浓度依赖地抑制V-ATP酶活性。推测杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶标与VATP酶有密切关系。

不同温度下福氏志贺菌与其膜囊泡的比较蛋白质组学研究

【目的】对不同温度下福氏志贺菌(Shigella flexneri)及其分泌的膜囊泡进行比较蛋白质组学分析,为进一步理解福氏志贺菌膜囊泡的生物学活性奠定基础。【方法】采用差速离心和密度梯度离心方法,分别富集纯化37℃和30℃培养条件下的野生型福氏志贺菌2a 301株和相应的膜囊泡;借助二维纳升液相色谱-线性离子阱质谱联用系统,对制备得到的4种组分蛋白进行鸟枪蛋白质组学鉴定分析。【结果】37℃和30℃培养条件下,福氏志贺菌菌体蛋白和膜囊泡蛋白的鉴定总数分别为1 510、231、1 412、281,4种组分的共有蛋白数为156。生物信息学分析结果发现:膜囊泡中特异性富集了核糖体结构蛋白和膜起源蛋白,且37℃培养条件下的膜囊泡特异包被了大量三型分泌系统相关蛋白。【结论】运用比较蛋白质组学技术首次分析了不同温度下福氏志贺菌及其膜囊泡的蛋白质组变化,发现一些温度相关的膜囊泡特异包被蛋白,为深入研究膜囊泡的选择性包被奠定基础。

单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及生物活性

【背景】细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是一种在自然界中普遍存在的包含生物学活性物质的囊泡状结构,其中包括革兰氏阳性菌分泌的膜囊泡(Membrane Vesicles,MVs)。近年来,单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)作为一种能产MVs的革兰氏阳性致病菌引起了众多科研人员的关注,尽管如此,对其MVs的了解仍然有限。【目的】建立健全Lm-MVs制备方法,同时深入了解其生物活性。【方法】以Lm野生菌株EGDe及其毒力突变株(EGDe△prfA、EGDe△prfA+pERL3-prfA*)为研究对象,利用超滤浓缩法和Optiprep密度梯度离心法提取Lm的MVs,并对这两种提取MVs的方法进行比较。此外,通过检测不同MVs对菌株生物被膜的影响,以及不同MVs的溶血活性和对棉铃虫的感染毒性来探究MVs的生物活性。【结果】相较于超滤浓缩法,Optiprep密度梯度离心法提取的Lm-MVs产率高、电镜观测效果好,但该方法操作相对复杂,耗时较长;不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200nm的MVs,而且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系;但MVs可以影响菌株生物被膜的形成,具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,而且其毒性与菌株本身毒性正相关。【结论】Lm分泌的MVs极有可能直接参与了Lm对宿主的致病,并在细菌-细菌之间以及细菌-宿主相互作用中扮演了重要角色。研究结果将对进一步研究革兰氏阳性菌MVs的形成和功能以及Lm的致病机制具有重要意义。

单增李斯特菌膜囊泡的提取及其表征与免疫效应分析

目的建立提取单增李斯特菌膜囊泡(Listeria monocytogenes membrane vesicles,LM-MVs)的方法,对LMMVs表征及诱导固有免疫应答的能力进行分析,为LM-MVs作为疫苗载体和药物递送平台的研究奠定基础。方法通过培养→离心→过滤→超滤浓缩→超速离心的方法提取单增李斯特菌分泌的膜囊泡,通过透射电子显微镜观察其形态特征,通过动态光散射分析测量其粒径分布,采用SDS-PAGE和Western blot分析其蛋白表达情况,采用CCK-8细胞增殖与毒性实验分析其对固有免疫细胞增殖能力的影响,采用实时荧光定量PCR对其刺激的固有免疫应答进行分析。结果成功建立提取LM-MVs的方法。透射电子显微镜下,LM-MVs呈现近圆形的膜状结构,动态光散射分析显示其大小为65~190 nm。SDS-PAGE和Western blot结果表明LM-MVs含有单增李斯特菌溶血素等蛋白。CCK-8细胞增殖与毒性实验中,10、20和50μg/mL的LM-MVs干预小鼠树突状细胞(DC 2.4)24 h后的增殖指数均高于未干预的DC 2.4细胞(P<0.05);0.1、1、10、20和50μg/mL的LM-MVs干预小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)24 h后的增殖指数均高于未干预的Raw 264.7细胞(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,50μg/mL的LM-MVs干预Raw 264.7细胞后肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和IL-10的表达量均高于未干预对照(P<0.05)。结论本研究建立的方法能够提取出单增李斯特菌分泌的膜囊泡,提取的LM-MVs直径为65~190 nm近圆形膜状结构,能分泌多种蛋白组分,能刺激固有免疫应答。

绿色杜氏藻被膜泡囊的超微结构研究

于1990年5月—1991年5月，运用透射电镜观察绿色杜氏藻，对该藻被膜泡囊的形态结构及其在细胞内的分布和形成过程进行研究。观察表明，绿色杜氏藻细胞的高尔基体和细胞膜附近有许多大小不等的被膜泡囊；这些被膜泡囊由泡囊及其表面的网状结构构成，其直径在45—120nm之间；在细胞膜附近的被膜泡囊直径较大；在高尔基体和细胞膜上还观察到被膜泡囊的形成过程。结果提示：在处于指数生长期的绿色杜氏藻细胞中，被膜泡囊起着细胞内大分子物质运输的作用。

大鼠脊髓内囊泡膜谷氨酸转运体与星形胶质细胞之间的联系(英文)

本研究应用双重免疫荧光组织化学法观察了大鼠脊髓胶质细胞内囊泡膜谷氨酸转运体 (VGlu Ts包括 VGlu T1,VG-lu T2及 VGlu T3 )的表达状况。结果显示 :大鼠脊髓内 VGlu T1、VGlu T2和 VGlu T3样阳性轴突终末与星形胶质细胞之间形成密切接触 ;部分星形胶质细胞同时呈 VGlu T3样免疫阳性。上述结果提示 ,脊髓内谷氨酸能神经终末与星形胶质细胞之间存在着信号传递 ;且在星形胶质细胞通过胞吐作用释放谷氨酸的过程中 VGlu T3可能发挥重要作用。

下颌神经切断术后Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体在大鼠三叉神经复合体中表达的变化

目的观察下颌神经切断术后不同存活时间I型囊泡膜谷氨酸转运体(VGluT1)样免疫阳性物质在大鼠三叉神经复合体中表达水平的变化。方法免疫细胞化学和图像分析技术。结果正常大鼠三叉神经复合体内可观察到大量的VGluT1样免疫阳性物质,且主要分布于终末内。切断一侧下颌神经后,手术侧与对照侧相比,术后存活1周组的Vp背侧部内VGluT1样阳性物质的表达有所下降(P<0.05);术后存活2周组的Vp背侧部、Vc背侧部、Vi背侧部,以及Vsup和Vmo内VGluT1样阳性物质的表达明显下降(P<0.01),且与术后存活1周组手术侧比较其下降有显著差异(P<0.05);术后存活3周组上述部位内VGIuT1样阳性物质表达的下降更加明显(P<0.01),且与前两组手术侧相比均有显著差异(P<0.01或P<0.05);其中在Vmo内的表达几乎完全消失。结论切断初级传入神经元的周围突可以导致其中枢突终末内VGluT1的表达水平下降;三叉神经复合体内部分VGIuT1样阳性终末来源于外周。

囊泡膜质子泵的研究

囊泡膜质子泵是维持细胞多种囊泡状细胞器酸化的一种H^+-ATPase。它对寡霉素、哇巴因和钒酸盐不敏感,但对巯基试剂如N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)很敏感,与线粒体F_0F_1-ATPase有很多相似之处。现已证明,真核细胞内的H^+-ATPase是一个由多个亚单位组成的大分子量的酶分子,它在电镜下的形态为具有小柄的基粒。囊泡膜H^+ATPase具有重要的生理功能,可促使受体与配体分离和受体的再循环,促使病毒与细胞膜融合;对Ly酶活性提供最适环境,使分泌颗粒中的生物胺聚积,激素前体转变成熟。

大鼠囊泡膜谷氨酸转运体样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系

最近在哺乳类动物脑内克隆出两种囊泡膜谷氨酸转运体— VGlu T1和 VGlu T2 ,目前人们已将两者作为脑内谷氨酸能终末的特异性标记物。本研究应用免疫荧光组织化学三重染色技术 ,在激光共聚焦显微镜下对大鼠三叉神经中脑核 (Vme)内VGlu T1/VGlu T2样和 P物质 (SP)样阳性终末与磷酸激活的谷氨酰胺酶 (PAG)样阳性神经元之间的联系进行了观察。结果显示 :(1) Vme内有较多的 PAG样阳性神经元 ,在吻尾方向上亘其全长出现 ,这些神经元绝大多数为大的假单极神经元 ,直径为2 5～ 5 0 μm。(2 )大量的 VGlu T1样、VGlu T2样和 SP样免疫阳性的神经纤维和终末广泛分布于 Vme内 ,其中 VGlu T2样阳性纤维和终末的分布密度高于 VGlu T1;部分 SP样阳性纤维和终末同时呈 VGlu T1样或 VGlu T2样免疫阳性。 (3 )一些 VGlu T1/VGlu T2样、SP样或 VGlu T1/VGlu T2和 SP双重标记的免疫阳性终扣分别包绕在 PAG样阳性的 Vm e神经元胞体周围 ,并与之形成密切接触。以上结果提示 :Vme神经元在将口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中 ,可能接受中枢其它来源的谷氨酸能和 SP能终末的调控 ,其中谷氨酸能的投射末梢可能通过与突触后膜上的相应受体结合而发挥作用而

缬氨霉素以及膜电位对菌紫质分子在脂质囊泡膜中运动的影响

用瞬间二向色性方法测量了菌紫质分子在DMPC脂质囊泡膜中的旋转扩散运动.观察了缬氨霉素和膜电位对菌紫质分子旋转扩散运动的影响.在低脂与蛋白比例时,缬氨霉素明显影响菌紫质分子的旋转扩散运动,在高脂与蛋白比例时,缬氨霉素对菌紫质分子的旋转扩散动的影响不明显.无论在高的或低的脂与蛋白比例下,膜电位都影响到菌紫质分子的旋转扩散运动.

大鼠囊泡膜谷氨酸转运体和5羟色胺阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系(英文)

本研究应用免疫荧光组织化学三重染色技术和免疫电镜双重标记技术,对大鼠囊泡膜谷氨酸转运体 (VGluT1和VGluT2)和 5 -羟色胺(5- HT)阳性终末与三叉神经中脑核(Vme)神经元之间的联系进行了观察。在激光共聚焦显微镜下,Vme内可观察到许多磷酸激活的谷氨酰胺酶(PAG)阳性神经元,其中绝大多数为大的假单极神经元。VGluT1和VGluT2免疫阳性的神经纤维和终末广泛分布于Vme内,其中VGluT2阳性纤维和终末的分布密度高于VGluT1。在Vme内还可观察到相当数量的 5- HT阳性终末,其中部分终末同时呈VGluT2免疫阳性。一些VGluT1、VGluT2、5- HT及VGluT2 /5- HT双重标记的阳性终末与PAG阳性的Vme神经元胞体形成密切接触。在电镜下,分别用银加强的金颗粒和DAB反应产物显示VGluT1 /VGluT2和 5- HT阳性终末。在Vme内只观察到部分终末呈VGluT2和 5- HT双重免疫阳性,并且这些终末主要形成非对称性突触。以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,谷氨酸能和 5 HT能神经终末可能通过Vme神经元对该信息进行复杂的调控。

大鼠脊髓内囊泡膜谷氨酸转运体1和囊泡膜谷氨酸转运体2阳性纤维和终末在生后发育中的分布和表达变化

目的探讨囊泡膜谷氨酸转运体1(VGLUT1)和VGLUT2阳性纤维和终末在生后第0天(P0)至第22天(P22)大鼠脊髓内的分布情况和表达变化。方法对生后发育P0~P22大鼠的颈膨大和腰膨大部位,进行VGLUT1和VGLUT2免疫组织化学染色。结果 P0~P22大鼠颈膨大和腰膨大脊髓内均可观察到VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末,但未观察到胞体样结构。VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末的分布呈现明显的互补分布,尤其是以脊髓后角更加明显。其中,VGLUT1阳性纤维和终末在P0主要见于颈膨大和腰膨大脊髓后角Ⅲ~Ⅴ层,中间部和前角很微弱。脊髓发育至P3,不仅Ⅲ~Ⅴ层VGLUT1的表达进一步增强,且向外侧部扩展,并在后角基底部Ⅵ层和前角的外侧部(Ⅸ层)也可观察到较强的VGLUT1阳性纤维,呈现一条明显由背内向腹外的带状分布趋势。P7时此带状分布更加明显,并随着发育逐渐向内、外扩展,至P22时已广泛分布于除Ⅱ层之外的整个脊髓。而VGLUT2阳性纤维和终末在P0时即密集出现于脊髓后角Ⅰ~Ⅱ层以及前角的外侧边缘区域;之后随着发育,VGLUT2阳性纤维和终末的分布模式并未发生明显改变,但其密度逐渐有所增加,特别是Ⅰ~Ⅱ层内VGLUT2阳性产物的表达尤为明显。另外,在脊髓白质后索内可见VGLUT1阳性皮质脊髓后束纤维由颈髓(P3)逐渐下降至腰髓(P7)的发育过程。结论 VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末在脊髓发育过程中呈现明显不同,且表现出互补分布的特点,这对于进一步理解VGLUT1和VGLUT2在脊髓生后发育过程中不同功能特点可能有意义。