大肠埃希菌细菌膜外蛋白A对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制

目的探讨大肠埃希菌细菌膜外蛋白A(outer-membrane protein A,OMPA)对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制。方法采用3种浓度的OMPA(10、20及40 ng/mL)作用于小肠上皮细胞,分别作用0、24、48和72 h,MTT法检测细胞的增殖情况。采用抑制效果最佳浓度的OMPA分别作用小肠上皮细胞0、20、40、60 min,通过Western blot法检测小肠上皮细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中ERK、JNK及p38的磷酸化情况。结果 20 ng/mL的OMPA作用48 h时对小肠上皮细胞的生长抑制程度最大,细胞生长率为(23. 12±0. 21)%。与作用0 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用20、40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P <0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P> 0. 05);与作用20 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P <0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 OMPA可抑制小肠上皮细胞的增殖,该抑制作用是通过抑制MAPK通路中JNK的磷酸化实现的。

利用肿瘤基因图谱公共数据集分析膜外基质金属蛋白酶-14在肺癌中的表达及临床意义

目的 通过肿瘤基因图谱(TCGA)数据库研究膜外基质金属蛋白酶-14(MMP14)在肺癌中的表达情况以及与肺癌临床病理特征的关系,进而推测MMP14对肺癌患者预后的影响,探讨MMP14在肺癌早期诊断中的作用。方法 检索TCGA中的肺癌数据集并下载资料,结合临床信息对芯片数据进行二次分析。采用R 3.6.3软件进行相关资料分析。结果 肺癌肿瘤组织中MMP14表达量高于正常组织(t=14.178,P<0.001)。在肺癌样本中,不同T分期的MMP14的表达量组间差异有统计学意义(P<0.001),T1、T2分期的MMP14表达量均比T3和T4低,早期肺癌的MMP14表达量与晚期相比有升高的趋势。Cox回归分析显示,TNM分期、MMP14和年龄是肺癌的独立危险因素。MMP14表达量与肺癌免疫细胞浸润的相关性分析显示,MMP14表达量与aDC、DC、iDC、单核细胞、中性粒细胞、NK细胞、TReg细胞、Th1和Th2细胞成正相关(P<0.001),与CD8 T细胞、嗜酸性粒细胞、Th17细胞成负相关(P<0.001),而与B细胞和T细胞无相关性(P>0.05)。结论 基于TCGA数据库分析发现MMP14在肺癌患者中高表达,在肺癌早期诊断中有一定的价值,并且与肺癌预后相关。MMP14在肺癌的早期诊断和预后中发挥着重要的作用,并可能成为预测肺癌预后的有用生物标志物。

NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。