缺铁诱导的水稻根转录本组和蛋白质组分析与膜泡运输

为了解水稻受缺铁胁迫后根细胞整体水平mRNA和蛋白质的变化规律,对缺铁和加铁的水稻根分别进行了转录本组的做点阵分析和翻译水平的蛋白质组双向电泳与基质辅助的激光解析时间飞行质谱(MALDI-TOF)分析.在10531个点的水稻cDNA芯片图谱上,比较缺铁与加铁之间的相对表达水平(REL),发现了451个差异cDNA点,其中在2.0～9.175之间的缺铁诱导上调基因为203个,在0.075～0.49之间缺铁诱导的下调基因为248个.在水稻根可溶性蛋白双向电泳(IEF-SDS-PAGE)结果中,得到多达约1500个点的蛋白质图谱.比较缺铁与EDTA螯合二价铁培养的水稻根可溶性蛋白质图谱,发现了23个差异蛋白质,其中缺铁诱导加强的有4个,减弱的有2个,特异的有7个.从缺铁处理的聚丙烯酰胺凝胶上选取差异蛋白质,用胰蛋白酶进行水解.继而进行了MALDI-TOF检测,获得9个蛋白质的肽质量指纹谱的检索数据和分析结果.最后对缺铁诱导的膜泡运输和能量代谢相关的基因做了详尽的分析.

参与植物膜泡运输的蛋白质家族及功能研究进展

真核细胞的内吞和分泌途径中蛋白质和脂类的运输主要由膜泡运输介导。参与膜泡运输的蛋白质家族包括SNARE蛋白家族、RAB蛋白家族、被膜蛋白复合体、Sec1蛋白家族、Arf蛋白家族。这些蛋白质家族在进化中高度保守,并且在植物中已经鉴定了许多哺乳动物和酵母蛋白的同源物。近年来一些研究发现这些蛋白质不仅仅调节植物细胞的膜泡运输,还影响植物的许多生理活动和功能,例如向重性生长、胞质分裂、激素极性运输、气孔运动以及抗病性等。现主要阐述迄今在植物中研究这五类蛋白质家族功能的最新进展。

SM蛋白在膜泡运输中的功能

大多数细胞内都包含靶向不同细胞器的各种运输囊泡,其运输机制在进化上是高度保守的。Sec1/Munc-18(SM)蛋白在膜泡运输中起着重要的调控作用,它能够与SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor)蛋白结合,共同在细胞内各个膜融合发生部位发挥重要作用。SM蛋白和SNARE复合体中的Syntaxin蛋白结合,调节SNARE复合体的装配,并与SNARE协同作用促进整个膜融合过程。文章对SM蛋白在结构和功能分析方面的最新研究进展进行了概述。

拟南芥SNARE因子在膜泡运输中的功能

高等植物细胞含有复杂的内膜系统,通过其特有的膜泡运输机制来完成细胞内和细胞间的物质交流。膜泡运输主要包括运输囊泡的出芽、定向移动、拴留和膜融合4个过程。这4个过程受到许多因子的调控,如Coat、SM、Tether、SNARE和Rab蛋白等,其中SNARE因子在膜融合过程中发挥重要功能。SNARE因子是小分子跨膜蛋白,分为定位于运输囊泡上的v-SNARE和定位于靶位膜上的t-SNARE,两类SNARE结合形成SNARE复合体,促进膜融合的发生。SNARE蛋白在调控植物体生长发育以及对外界环境响应等生理过程中起重要作用。该文对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)SNARE因子的最新细胞内定位和功能分析等研究进展进行了概述。

膜泡运输中小泡的类型及作用

介绍了膜泡运输中三种不同类型的有被小泡，即披网格蛋白小泡、copⅡ被膜小泡和copⅠ被膜小泡的形成机制及作用。

真核细胞内膜泡运输的分子机制

真核细胞内一些蛋白质需靠膜泡进行定向运输。膜泡是在外衣蛋白的作用下形成的;根据外衣蛋白的不同,膜泡分为笼蛋白、COPⅠ和COPⅡ外衣膜泡。这些外衣膜泡分别在细胞内不同供膜（donor membrane）处形成,因为被运输蛋白具有分选信号可与供膜上相应的受体结合,所以能被包裹在特异的膜泡之中。在膜泡形成过程中,外衣蛋白在“芽生”膜泡的细胞质侧组装成笼状外衣,帮助“芽生”膜泡从供膜处脱落。一旦笼状外衣膜泡脱离供膜,笼状外衣蛋白便发生解聚而成为无衣膜泡,无衣膜泡在Rab蛋白的调控下可定向运输蛋白质。而解聚后的外衣蛋白可重新介导新的外衣膜泡形成。

缺铁水稻根转录本组及与膜泡运输相关基因的分析

随着大规模芯片技术(即cDNA微点阵)的开展,这一技术已用于胁迫基因表达的转录本组分析。本论文重点阐述转录 本图谱分析的方法,以及缺铁胁迫下,水稻的基因组表达差异,其中重点是与膜泡运输相关的几个基因。

参与膜泡运输的蛋白家族及其运行机制的研究进展

细胞的生长和分化最终体现在蛋白质的差异上 ,蛋白质在胞浆中的核糖体合成后 ,便被运送到特定的细胞器、细胞膜或者分泌到细胞外。细胞在其生长、发育、衰老、死亡等过程中 ,都伴随着特定蛋白的定位及运输。膜泡运输对于完成细胞器及细胞膜之间的蛋白运输功能至关重要 ,目前已发现了参与这一过程的 4个蛋白家族 ,并对其基本的运行机制有了一定的了解。

细胞内膜泡运输中拴系因子的功能

膜泡运输是不同细胞器间进行物质传递的基本方式,分为4个重要步骤:囊泡的出芽、转运、拴系和融合。在此过程中,有许多相关因子参与调控,如包被蛋白、Rab蛋白、拴系因子、SM蛋白和SNARE等。拴系因子在运输囊泡和靶位膜发生接触的最初阶段起重要调控作用,多数拴系因子形成大的多亚基复合体发挥功能。目前,关于拴系因子的功能已经有了一定的了解,在此,我们对酵母、哺乳动物以及植物细胞中的已知拴系因子的特点和功能进行了概述。

ROP2参与植物生长素快速响应的膜泡运输调控

ROP2(Rho-related GTPases from plant)为植物中特有的小G蛋白Rho家族的成员,参与植物细胞信号转导过程。为了探讨其在生长素信号响应过程中对细胞膜泡运输的调控作用,构建了拟南芥ROP2过表达(OX-ROP2)、组成激活型表达(CA-rop2)和显性失活型表达(DN-rop2)的载体,分别转化到膜泡标记和生长素结合蛋白ABP1(auxin binding protein 1)调控表达的烟草BY2细胞系,结合生长素处理开展了ROP2对细胞生长素作用下膜泡运输的调控。在生长素IAA作用下,ROP2的过表达和组成激活型表达都能明显促进细胞的膜泡外排运输,而ROP2的显性失活型表达则抑制细胞膜泡外排运输。如果同时诱导细胞中ABP1过表达,能显著增强ROP2对膜泡外排运输的促进作用,而ABP1受干扰抑制表达时,ROP2的过表达及组成型激活表达对膜泡外排的促进作用都受到明显抑制。IAA处理细胞2 min时就可以观察到细胞对IAA信号响应的膜泡运输明显变化,此时细胞核向内膜系统、内膜系统向细胞质膜之间的膜泡外排运输逐渐增强,外排运输的方向趋向于生长素高浓度方向更活跃。该研究说明,植物ROP2参与生长素快速响应的信号转导途径,能促进膜泡朝向生长素浓度较高的一侧外排运输。

物质跨膜运输相关概念辨析

本文对物质跨膜运输过程中涉及到的信号分子和受体、膜转运蛋白以及被动运输、主动运输、膜泡运输等各种运输方式进行相关概念辨析。

EoRab43参与游仆虫细胞内大核周围的物质运输

Rab家族蛋白是真核细胞内膜泡运输途径中重要的调节因子。EoRab43是八肋游仆虫中一种编码非典型Rab蛋白的基因。本研究依据已获得的EoRab43基因序列设计引物,从八肋游仆虫大核DNA中扩增了EoRab43基因的3′端153bp片段,即EoRab43153bp(对应于EoRab43蛋白的C末端50个氨基酸,EoRab43C),构建重组表达质粒pGEX-EoRab43153bp转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,纯化后的融合蛋白GST-EoRab43C免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。经检测,制备的抗体具有较高的效价及良好的特异性。利用制备的抗体对EoRab43在游仆虫细胞内进行免疫荧光定位,结果显示该蛋白主要定位于该生物细胞内大核染色体的周围。

植物生长素通过ABP1促进细胞膜泡的外排运输

为了研究植物生长素结合蛋白ABP1（auxin binding protein 1）对膜泡运输的调控,将烟草生长素结合蛋白基因ABP1 cDNA分别构建成可诱导型表达的过表达和干扰表达载体,并将绿色荧光蛋白GFP与烟草分泌载体膜蛋白SCAMP2（secretory carrier membrane protein 2）融合进行细胞的膜泡标记,转化植物模式细胞BY-2后分别获得了转ABP1和antiABP1的两类膜泡标记转基因细胞系。以雌二醇诱导ABP1、antiABP1表达后,结合生长素处理,通过扫描激光共聚焦观察了细胞的膜泡运输变化。当诱导ABP1在细胞内过量表达后,以吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）处理细胞,在细胞核膜及周围内质网膜、细胞质膜以及其他细胞内膜系统都观察到强烈的荧光信号,说明细胞内膜泡运输更为活跃;当诱导antiABP1在细胞内干扰表达时,在细胞核附近维持有较强烈的荧光信号,而细胞质膜及两细胞间隔的荧光信号明显减弱,表明抑制ABP1表达显著抑制了细胞膜泡的外排运输。在ABP1经诱导过表达后,加入IAA处理细胞,在0-6 min时间段内间隔性观察了细胞膜泡对生长素的时间响应,在这段时间内细胞核周围及内膜系统的荧光信号明显增强,细胞质膜的荧光强度没有明显的变化,表明细胞核与内膜系统间存在活跃的膜泡运输,内膜系统向细胞质膜间的外排膜泡运输也逐渐加强。因此,可以证明ABP1参与生长素信号响应,增强细胞膜泡的外排运输。

Livin与肿瘤研究新进展

Livin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,具有凋亡抑制蛋白家族的特征性结构——BIR结构域。这一结构域介导了Livin与Caspase-3、7、9的直接结合,从而阻断caspase凋亡作用的发挥,达到抑制细胞凋亡的作用。Livin基因定位于染色体20q13,编码Livinα和β两种蛋白。亚细胞定位显示,在细胞质和细胞核均有表达,羧基末端的RING结构域介导了Livin的亚细胞定位。目前的研究表明,Livin可表达于消化系统的胃癌、泌尿系统的膀胱癌、呼吸系统肺癌和血液系统的淋巴细胞性白血病等多个系统的肿瘤中,也存在于乳腺癌及黑色素瘤中,在肿瘤的细胞系中也有较广泛的表达,但在各系统的正常组织中却很少表达。研究还表明,在药物诱导凋亡时,Livin的表达有明显升高。用RNA干扰技术对Livin基因的表达进行干预后,细胞对诱导凋亡药物和放射线的敏感性增加。根据Livin设计的抗原肽可以特异性诱导肺癌患者杀伤性T细胞的活化。目前的研究已表明,Livin在肿瘤的发展和耐药中都有重要作用。Livin特异表达于肿瘤组织的特性有可能为肿瘤的早期诊断、基因治疗和细胞治疗提供新靶点。

稳定表达Keap1的H460-N5细胞株的建立及增敏抗肿瘤药物作用的研究

目的:建立野生型Keap1过表达的H460细胞株降表达Nrf2,检测Nrf2-ARE信号通路对肿瘤细胞耐药性的影响。方法:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后经过长期筛选得到稳定表达Keap1蛋白质的细胞株,通过Western blotting和荧光定量PCR的方法进行检测;并通过多次继代培养,细胞株H460-N5稳定表达mKeap1,Nrf2及其调控基因均显著降表达;用MTS法检测抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对细胞增殖抑制率。结果:H460细胞转染mKeap1-pEGFP后筛选建立Nrf2降表达的稳定细胞株H460-N5。MTS数据显示,与对照组相比,抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对H460-N5细胞的抗增殖作用更显著。当奥沙利铂和依托泊苷分别在93μmol/L和100μmol/L浓度作用于对照组细胞株H460-N0时,药物作用接近半数抑制率(IC50);而在H460-N5细胞株中,两种抗癌药物的IC50分别为42μmol/L和30μmol/L。阿霉素对H460-N0细胞的IC50>3 mg/L,而对H460-N5细胞的IC50约为2 mg/L。结论:Keap1过表达的H460-N5细胞Nrf2及调控基因显著降低并增敏抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

植物种子贮藏蛋白质及其细胞内转运与加工

高等植物种子成熟过程中贮存大量的贮藏蛋白质作为种子发芽和初期生长的重要营养来源。根据溶解性不同,种子贮藏蛋白质可分为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4类。在种子胚发育过程中,醇溶蛋白在粗面内质网合成后形成蛋白质聚集体,直接出芽形成蛋白体并贮存其中。白蛋白、球蛋白和谷蛋白在粗面内质网以分子量较大的前体形式合成后,根据各自的分选信号进入特定的运输囊泡,经由受体依赖型运输/聚集体形式运输转运至蛋白质贮藏型液泡中,然后经过液泡加工酶等的剪切转换为成熟型贮藏蛋白质并贮存其中。蛋白质的合成、分选、转运和加工等过程影响种子蛋白质的品质及含量。该文对种子贮藏蛋白质的分类和运输、加工以及这些过程对种子蛋白质品质和含量的影响进行了概述。

水稻OsRab5a基因功能的初步分析

水稻OsRab5a基因在根、茎、叶、根茎结合部和颖片及愈伤组织中均有表达;OsRab5a蛋白主要参与细胞内吞过程的早期膜泡运输,GFP-OsRab5a主要存在于细胞膜上和早期内吞小体中,而GFP-OsRab5aCA则大多存在于细胞膜上。OsRab5aRNA干涉载体转化水稻愈伤组织后,导致愈伤组织在分化过程中死亡,OsRab5a基因的表达略受细胞分裂素的诱导,在分化过程中表达增强,从而推测OsRab5a可能参与激素的信号转导而在愈伤分化过程中发挥重要作用。

家蚕Bmβ-COP基因结构及功能

采用克隆测序、生物信息学分析及表达谱检测等方法,分析了家蚕Bmβ-COP基因的结构和功能特征,探索其与丝蛋白合成的关系。结果表明,Bmβ-COP基因在家蚕基因组中为单一拷贝,也没有选择性剪接异构体存在;在不同产丝能力的家蚕品种及其不同组织间没有表达差异;Bmβ-COP基因与不同家蚕品种间丝物质生产能力差异没有直接关联,但破坏它会影响丝腺的发育和功能,对家蚕丝蛋白合成、分泌产生不利影响。

真核细胞内蛋白质的定向转运

真核细胞内的蛋白质合成以后要被运送至不同部位行使不同的功能。根据转运机制的不同,分为膜泡运输、跨膜转运以及选择性的门控转运。无论通过哪一种方式转运,存在于蛋白质中起信号作用的氨基酸序列是必不可少的。