EB病毒膜潜伏蛋白LMP-1筛选鼻咽癌的初步结果

背景与目的:早期诊断鼻咽癌是提高疗效的重要途径,而目前临床上用于鼻咽癌早期诊断的指标存在灵敏度及特异度不理想的问题,EB病毒膜潜伏蛋白LMP-1是目前被证实的具有转化功能的蛋白质之一,本研究旨在探讨LMP-1作为鼻咽癌筛选指标的价值。方法:收集2007—2008年期间以耳鼻咽喉症状到福建省肿瘤医院放疗科就诊并同意参加本试验的患者300例,利用鼻咽拭子法取鼻咽部黏膜脱落细胞,提取DNA,聚合酶链反应法(PCR法)检测LMP-1基因的表达,所有入组患者均行鼻咽组织病理活检明确诊断。结果:300份鼻咽拭子标本提取了有效DNA样本数243份,合格率81%。非鼻咽癌的患者及健康者中,LMP-1的阳性表达率为3.70%(4/108),明显低于鼻咽癌患者(P<0.05)。LMP-1诊断鼻咽癌的灵敏度为88.15%(119/135),特异度为96.30%(104/108),阳性预测值为96.75%(119/123),阴性预测值为86.67%(104/120),正确率为91.77%,Youden指数为84.45%。结论:利用PCR法检测鼻咽拭子中鼻咽黏膜脱落细胞EB病毒膜潜伏蛋白LMP-1的表达作为鼻咽癌筛选的指标可重复性好,具有较高的灵敏度和特异度,适合作为高危人群的筛查指标。

EB病毒潜伏膜蛋白LMP-1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的观察EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)在鼻咽癌(NPC)鼻咽拭子中的表达,探讨LMP-1表达与NPC临床病理特征的关系。方法纳入2007年～2008年福建省肿瘤医院放疗科收治的经病理检查确诊为NPC且同意参加该试验的初治患者129例,均在治疗前应用鼻咽拭子法取鼻咽部黏膜脱落细胞,提取DNA,采用PCR法检测LMP-1基因的表达。结果 129例患者中有114例患者LMP-1呈阳性表达,另15例呈阴性表达,阳性率为88.37%(114/129);对照组中无1例呈阳性表达。LMP-1阳性表达率有颈部淋巴结转移组明显高于无颈部淋巴结转移组。LMP-1表达与患者年龄、性别、临床分期、T分期及M分期无相关性。结论 PCR法检测鼻咽拭子中LMP-1的检出率高于免疫组化法,LMP-1表达与鼻咽癌患者颈部淋巴结转移密切相关,临床中可预测鼻咽癌患者的转移潜能,LMP-1可能做为抗肿瘤转移靶向治疗的潜在靶点。

潜伏膜蛋白(LMP-1)源短肽对周围血单个核细胞增殖的影响

目的 探讨LMP 1来源的LALLFWL短肽对人外周血单个核细胞的免疫抑制作用。方法 利用MTT比色法进行检测体外培养人外周血单个核细胞在此短肽作用下的转化情况。结果 LALLFWL短肽对人外周血单个核细胞转化有明显抑制作用 ,测定组与对照组有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,并呈剂量依赖关系。结论 LMP 1来源的LALLFWL短肽具有抑制人外周血单个核细胞转化的作用 ,能抑制机体的细胞免疫功能。

mic2/CD99在经典型霍奇金淋巴瘤H/RS细胞中的表达及与Eber-1/LMP-1相关性的研究

目的:检测mic2基因与CD99蛋白和Eber-1基因与潜伏膜蛋白-1(LMP1)在经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)H/RS细胞中的表达,探讨mic2/CD99表达与Eber-1/LMP-1的相关性。方法:采用分子原位杂交和免疫组化技术并结合组织芯片技术检测59例石蜡包埋淋巴瘤组织标本[43例cHL,16例非霍奇金淋巴瘤(NHL)]mic2/CD99和Eber-1/LMP-1的表达,比较分析mic2/CD99在两组中的表达及与Eber-1/LMP-1的关系。结果:cHL组CD99蛋白表达阳性率为2·3%,mic2基因表达为55·8%,LMP1表达为58·1%,Eber-1表达为53·5%;NHL组CD99蛋白与mic2基因表达高于cHL组(P<0·05);LMP1和Eber-1的表达低于cHL组(P<0·05);mic2基因的表达高于CD99蛋白的表达(P<0·05);Eber-1与LMP1的表达无统计学意义(P>0·05)。CD99蛋白与LMP1的表达呈负相关(P<0·05),各项指标的表达与性别无关。CD99蛋白与LMP1的表达与年龄呈负相关(P<0·05),mic2与Eber-1的表达与年龄无关(P>0·05)。结论:CD99蛋白在cHL H/RS细胞中低表达,并与LMP1的表达呈负相关。

VEGF、LMP-1在鼻咽癌中的表达及其与预后的相关性

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)、EB病毒膜潜伏蛋白-1(LMP-1)在鼻咽癌中的表达及其与预后的相关性。方法:收集50例鼻咽癌患者的临床资料及鼻咽部瘤体活检组织蜡块。采用免疫组化S-P法检测蜡块标本中VEGF、LMP-1的表达情况。VEGF、LMP-1与淋巴结转移的关系,LMP-1与VEGF相互关系采用Spearman秩相关法进行相关分析。采用Cox比例风险模型对导致鼻咽癌患者不良预后的各种因素进行多因素分析,筛选出对预后有显著意义的独立预后因素,并应用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果:VEGF和LMP-1的阳性表达率分别为58%和50%,它们的表达均与颈淋巴结转移关系密切(P<0.05)。LMP-1与VEGF表达呈显著正相关(r=0.717,P<0.001)。鼻咽癌预后不良的危险因素是VEGF和LMP-1表达阳性(P<0.05)。结论:VEGF、LMP-1在鼻咽癌中的阳性表达与颈淋巴结转移明显相关,LMP-1能上调VEGF表达,从而增强鼻咽癌的转移潜能。二者可作为预测鼻咽癌预后的指标,从而指导临床制定个体化治疗方案,提高鼻咽癌的生存率。

EBV感染后LMP-1阳性霍奇金淋巴瘤患者临床特点及预后分析

本研究探讨霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)组织内EB病毒感染诱导潜伏膜蛋白1(latent membrane protein-1,LMP-1)的阳性率及CD68阳性肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)计数状况,分析其与HL患者临床特征及预后的相关性。采用免疫组织化学方法检测72例HL组织标本中LMP-1和CD68阳性TAM计数,并统计学分析其与临床特征及预后的关系。结果表明,72例HL组织标本中,LMP-1阳性率为18.1%(13/72),LMP-1阳性表达情况下CD68阳性TAM计数更多(以CD68阳性TAM数目250/hpf为分界点,P=0.003);统计学分析显示混合细胞型HL中LMP-1阳性更为多见(P=0.000)。在白蛋白水平<40 g/L及年龄≥45岁的患者中LMP-1阳性率更高(P<0.05);LMP-1表达状况和CD68阳性TAM计数与本组HL的近期疗效未见相关性;但在随访时间≥5年的HL患者中,LMP-1阳性患者的总生存期较短(P=0.040),但CD68阳性TAM计数和HL患者的总生存期之间无统计学相关性。结论:HL组织中LMP-1阳性情况下CD68阳性TAM计数高更为多见;LMP-1表达状态和HL患者的病理类型、年龄以及白蛋白水平均存在相关性,LMP-1阳性HL患者预后不良,提示LMP-1有可能成为HL患者的一种新的预后标记物。

小干扰RNA抑制EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的探讨人工诱导RNA干扰技术在EB病毒潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP-1)功能研究中的应用价值,观察LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞生长的影响。方法人工合成4条双链不同序列的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),通过脂质体转染导入表达EB病毒基因的鼻咽癌C611细胞后,用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RTPCR)检测LMP1mRNA水平,筛选出能有效抑制LMP-1表达的siRNA序列。采用噻唑蓝法和流式细胞仪观察LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的变化。结果导入有效siRNA后,C611细胞中LMP-1mRNA水平下降90%以上,重复转染可使有效干扰时间延长至96h。LMP-1基因抑制后,EB病毒阳性的C611细胞增殖速度最多可下降至32.9%;细胞周期在G0G1期受阻。在同样处理下,EB病毒阴性的HNE2细胞的生长则未受到影响。结论全新的人工诱导RNA干扰技术能够有效抑制LMP1基因的表达,降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。

鼻咽癌细胞LMP1的表达与其对TRAIL敏感性的关系

目的探讨鼻咽癌(NPC)细胞EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)表达与其对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)敏感性的关系。方法运用RT-PCR、Western blot分别检测3种不同的鼻咽癌细胞中LMP1mRNA和蛋白的表达情况,并运用MTT比色法、流式细胞术检测这3种细胞对TRAIL凋亡诱导作用的敏感性。结果 C666-1中LMP1 mRNA及蛋白表达最高,CNE-1中LMP1 mRNA及蛋白表达最低。鼻咽癌细胞的存活率随TRAIL浓度提高或作用时间的延长而降低,凋亡率随TRAIL浓度提高或作用时间的延长而提高。CNE-1对TRAIL的敏感性最高,而C666-1对TRAIL的敏感性最低。结论 TRAIL可以诱导鼻咽癌细胞发生凋亡;不同鼻咽癌细胞对TRAIL的敏感性与LMP1表达相关,提示LMP1可能是影响TRAIL敏感性的抗凋亡因子。

LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1癌基因微小RNA表达谱的影响

目的:比较鼻咽癌细胞系CNE1与其EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)稳定转染细胞系CNE1-LMP1的癌基因微小RNA(oncomiRs)表达谱的差异,探讨LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1 oncomiRs表达的影响。方法:采用包含132个oncomiRs分子的microRNA芯片分析CNE1与CNE1-LMP1的表达差异,并采用荧光定量PCR验证差异表达明显的oncomiRs分子。结果:二者共检出30个miRNA分子,CNE1中检出miRNA分子19个;其中11个为CNE1-LMP1特异性表达。在共同表达的19个miRNA分子中,在CNE1-LMP1中表达升高2倍以上的miRNA分子有6个:hsa-miR-19b、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-149、hsa-miR-150和hsa-miR-188。没有表达降低2倍以上的分子。在CNE1-LMP1特异性表达的11个miRNA中,hsa-miR-122a呈高水平表达,其表达水平超过内对照。通过荧光定量PCR验证6个差异分子的表达,发现改变倍数与芯片结果一致(P<0.01)。结论:LMP1能影响oncomiRs表达谱,可能是LMP1作为病毒癌基因发挥作用的另一重要途径。

丝裂霉素C对鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1抑制作用及其机制

目的探讨丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)对鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1生长抑制作用及其机制。方法以体外培养的鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1为研究对象,以不同浓度的MMC(40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL)作用于HNE2和HNE2/lmp1细胞,MTS法检测MMC对人鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1生长的抑制作用;荧光显微镜观察MMC干预24 h前后HNE2细胞的形态变化;流式细胞仪检测MMC对鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1凋亡及细胞周期的影响;比色法检测MMC作用于HNE2和HNE2/lmp1细胞后Caspase-3的活化度变化。结果MMC对HNE2和HNE2/lmp1细胞生长有明显的抑制作用,呈剂量依赖性。40μg/mlMMC作用于HNE2和HNE2/lmp1细胞24 h的抑制率分别为(72.97±4.93)%和(69.42±2.94)%。MMC作用于HNE2细胞后可见悬浮细胞增多,细胞胞体缩小、变圆、碎裂,胞内出现颗粒样物质。流式细胞仪检测表明,MMC对HNE2和HNE2/lmp1肿瘤细胞的抑制主要表现为诱导细胞凋亡,凋亡率分别由4.46%和0.75%增高至18.09%和10.27%,而对细胞周期的影响较小。MMC能明显上调HNE2和HNE2/lmp1细胞Caspase-3活性,MMC浓度越高作用时间越长caspas-3活化度越高,在浓度和时间水平存在差异。统计结果显示HNE2/lmp1细胞较HNE2细胞有较高的对抗丝裂霉素抑制作用的能力。两细胞组caspas-3活化度也相应存在差异。结论MMC可明显抑制鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1的生长,促进细胞凋亡,其机制和Caspase-3有关。EBV-潜伏膜蛋白1(latent membrance protein 1,lmp1)可通过caspase-3途径抑制HNE2细胞的凋亡对抗丝裂霉素的细胞生长抑制作用。

儿童皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤临床病理特点及其与EB病毒关系的研究

目的:研究儿童皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(SPTCL)的临床和病理特点及与EB病毒感染的关系。方法:选用CD20、CD45RO、CD68、CD30、CD56、TIA-1等抗体作免疫组织化学ABC法染色;应用EBER1/2原位杂交检测EB病毒。结果:13例SPTCL占同期观察的皮肤非何杰金淋巴瘤的36.1%,其中男8例,女5例;发病年龄平均4.8岁;主要表现为下肢、躯干无症状性结节或肿块,常伴发热和肝脾肿大。组织学特点为肿瘤在皮下脂肪内呈脂膜炎样浸润,瘤细胞大小不等、形态各异,瘤内可见上皮样肉芽肿、多核巨细胞、豆袋细胞、小片坏死。免疫表型:TIA-1抗体表达12例,13例CD45RO均为阳性,CD20、CD30、CD56均为阴性;EB病毒EBER1/2原位杂交阳性率38.5%。13例中随访10例,死亡5例,其中4例合并噬血细胞综合征(HPS),4例中EBER阳性3例。结论:SPTCL在儿童皮肤非何杰金淋巴瘤中并不少见。儿童SPTCL可能与EB病毒潜伏感染有一定的相关性。与EB病毒相关的SPTCL具有更大的侵袭性,常伴有HPS,预后较差。

LMP2A调节EBV相关胃癌细胞中PD-L1的表达

目的探讨膜潜伏蛋白2A(LMP2A)调节EB病毒(EBV)相关胃癌(EBVaGC)细胞中程序性死亡蛋白-配体1(PD-L1)的表达,并分析LMP2A和PD-L1在胃癌细胞株中的表达及关系。方法选取人胃癌细胞株SNU-719[EBV阳性(EBV+)]、AGS[EBV阴性(EBV-)],采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测胃癌细胞株SNU-719(EBV+)及AGS(EBV-)中LMP2A和PD-L1基因的表达水平,佛波醇(TPA)诱导SNU-719(EBV+)和AGS(EBV-)中LMP2A的表达后,蛋白质印迹法(WB)检测LMP2A、PD-L1蛋白表达水平的变化。结果PD-L1在EBV阳性细胞株SNU-719(EBV+)中的表达水平明显高于在AGS(EBV-)中的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。SNU-719(EBV+)中LMP2A mRNA转录水平明显高于AGS(EBV-)细胞株,差异具有统计学意义(P<0.05);AGS(EBV-)、SNU-719(EBV+)细胞株中PD-L1和LMP2A mRNA转录水平具有一致性。诱导12、24、48 h,LMP2A在SNU-719(EBV+)细胞株中表达呈上升趋势,而AGS(EBV-)细胞株无变化。TPA诱导12 h后,SNU-719(EBV+)细胞PD-L1表达明显升高,而AGS(EBV-)细胞株升高不明显。结论EBV相关胃癌可能通过LMP2A介导的致癌途径上调PD-L1表达,从而引起肿瘤免疫逃逸。这提示阻断LMP2A致癌途径和PD-1/PD-L1检查点抑制通路可为EBV感染的胃癌患者带来潜在临床益处。

EBER1／2、LMP—1在鼻腔非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

目的 探讨EBER1／2、LMP—1在鼻腔非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达及意义。方法采用免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化酶连接法(SP法)检测CD45RO、CD3e、CD20、TIA—1、粒酶B确定肿瘤细胞免疫表型，原住杂交(In situ hybridization,ISH)方法检测EB病毒（EBV)编码的RNA（EBER1／2)、免疫组织化学方法检测EBV潜伏膜蛋白(LMP—1)。结果29例鼻腔NHL中，CD45RO阳性29例(100.00％)，CD3e、TIA—1、粒酶B阳性19例(65.56%）CD20全部阴性；EBER1／2阳性率为79．62％(23/29)，LMP—1阳性率为48.28％(14/29)。结论EBV与鼻腔NHL密切相关，EB病毒在鼻腔非霍奇金淋巴瘤的发生发展中可能起重要作用，EBER1／2原住杂交检测及LMP-1免疫组化检测可作为鼻腔非霍奇金淋巴瘤组织学诊断的辅助依据。

鼻咽癌组织中EB病毒潜伏相关基因的表达

目的:通过检测鼻咽癌组织中EB病毒的潜伏膜蛋白LMP1的序列以及LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达来探讨EB病毒的感染状态及其表达产物与鼻咽癌的关系。方法:应用PCR法检测鼻咽癌组织中LMP1 DNA的存在,并对鼻咽癌来源的LMP1和EB病毒永生化狨猴B淋巴细胞系B95-8来源的LMP1进行测序,比较序列的差异。利用巢式RT-PCR检测鼻咽癌组织中LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达。结果:47例鼻咽癌组织均含有LMP1 DNA,所有鼻咽癌来源的LMP1 DNA与B95-8来源的LMP1 DNA序列比较均存在着多个单核苷酸变异,最明显的是XhoⅠ酶切位点的丢失。测序后显示鼻咽癌来源的LMP1DNA有30个核苷酸的丢失。巢式RT-PCR显示LMP1、EBNA1、EBNA2在鼻咽癌中的mRNA表达率分别为76.6%、80.0%和74.5%。其中EB-NA1的表达是由Qp启动的,而B95-8细胞中EBNA1的表达是由Cp启动的。结论:鼻咽癌中EB病毒的作用途径比较复杂,LMP1、EBNA1、EBNA2等潜伏期基因还有早期裂解基因BARF1均可能参与鼻咽癌的发生发展过程。

EB病毒阳性肺癌组织中LMP-1、p53、Bcl-2及MMP-9表达

[目的]检测EB病毒(EBV)阳性肺癌组织中EBV潜伏感染膜蛋白-1(LMP-1)、p53、Bcl-2及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达情况,分析它们与肺癌发生发展的关系。[方法]采用原位杂交法检测108例肺癌组织和22例癌旁正常肺组织中EBV编码的小RNA-1(EBV encoded small RNA-1,EBER-1)。免疫组织化学的方法检测EBER-1阳性和阴性肺癌组织中LMP-1、p53、Bcl-2及MMP-9的表达。[结果]108例肺癌组织中EBER-1阳性36例,阳性率33.3%;22例癌旁正常肺组织中EBER-1阳性1例,阳性率4.5%,差异有统计学意义(P<0.01)。EBER-1阳性和阴性的肺癌组织中LMP-1阳性率分别为11.1%和4.2%,差异无统计学意义(P>0.05);在EBER-1阳性肺癌组织中p53、Bcl-2的平均面积(AA)和积分光密度(IOD)均高于阴性组,差异有统计学意义。在EBER-1阳性肺癌组织中MMP-9AA和IOD均高于阴性组,但差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]EBV感染可能通过影响LMP-1、Bcl-2、p53和MMP-9在肺癌组织中的表达,进而在肺癌的发生、发展和转移中发挥作用。

耳、鼻、咽、喉

鼻咽癌低分化鳞癌组织中catenins和cyclin D1的表达及其临床意义；病毒潜伏膜蛋白（LMP1）与survivtn在鼻咽癌中的表达；鼻咽癌组织中ku强白表达与放射敏感性及预后的关系；PCNA和PTEN的表达水平在鼻咽癌预后判断中的意义；DNA载体介导RNA干扰抑制LMP-1基因对鼻咽癌细胞转移能力的影响。

抑制PI3K-Akt通路逆转LMP1诱导的鼻咽癌细胞TRAIL抵抗

目的:在鼻咽癌细胞株中检测阻断PI3K-Akt信号通路对EB病毒膜潜伏蛋白1(LMP1)诱导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抵抗的作用。方法:运用Western blot检测LMP1过表达后Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表达改变;选用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制PI3K-Akt信号通路后,MTT及流式细胞术观测CNE-1、CNE-1-LMP1对TRAIL敏感性的改变;Western blot检测细胞外信号通路的激活情况。结果:CNE-1-LMP1细胞p-Akt蛋白表达明显高于CNE-1细胞。1μmol/ml LY294002预处理8h后的CNE-1和CNE-1-LMP1细胞中p-Akt的表达明显降低,且2种细胞间p-Akt的表达差异无统计学意义(P>0.05)。MTT及流式细胞术结果显示LY294002预处理后,CNE-1-LMP1细胞对TRAIL的敏感性明显提高,达到CNE-1细胞的水平。结论:LMP1是通过激活PI3K-Akt信号通路诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗,提示针对PI3K-Akt信号通路的鼻咽癌靶向治疗方案可能逆转LMP1诱导的TRAIL抵抗。

EB病毒肺炎一例

EB病毒（Epstein-Bar rvirus,EBV）是Epstein和Barr于1964年在非洲儿童Burkitt淋巴瘤细胞中发现的人类疱疹病毒.成人感染EBV后临床表现和转归多种多样,可有原发急性感染、慢性活动性感染、淋巴增殖性疾病、肿瘤等[1].无论宿主的免疫功能如何,EBV肺炎是罕见的[2],我们通过血清抗体和肺组织病理诊断1例EB病毒间质性肺炎,现报道如下.