膜片钳制技术及其在心血管研究中的应用

神经、肌肉、腺体、感官等器官和组织,在生命活动中发挥着重要的生理功能,其基础是这些组织的细胞在各种刺激作用下能产生电兴奋,这种电兴奋是由于细胞膜上的通道对各种离子的通透性变化的结果。因此,研究膜对各种离子的通透机制,阐明离子通道功能与结构的关系,有助于解释生物体的电现象和其它生命现象,同时,对于了解药物与离子通道的相互作用机理也具有重要的理论意义和广泛的应用前景。八十年代初发展起来的膜片钳制技术(patch clamp technique)为从分子水平上了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息,提供了最直接的手段。这种技术的兴起与应用,使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭新的阶段。也是电生理研究方法的革命性突破。本文就对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一简要综述。

白花前胡甲素对豚鼠单一心室肌细胞Ⅰ_K通道作用机制的初步探讨

目的通过比较白花前胡甲素（Pd－Ia）与异丙肾上腺素对豚鼠单一心室肌细胞迟发性外向钾电流（IK）的影响，初步探讨Pd－Ia开放钾通道作用的可能机制。方法；应用全细胞膜片钳制技术。结果与结论：Pd－Ia对IK通道作用的最大效应与异丙肾上腺素相近，均使IK增加2～2．5倍，对IK的激活动力学过程均无明显影响，而且两药的作用不具有相加性。另外，乙酰胆碱对Pd－Ia增加IK作用的影响也与对异丙肾上腺素的影响相似，提示Pd－Ia对IK的作用可能是通过激活PKA而产生的。其确切机制还有待进一步实验研究。

灯盏花素对豚鼠心室肌细胞迟发性外向钾电流的影响

目的 观察灯盏花素对心室肌细胞迟发性外向钾离子电流的影响。方法 应用全细胞膜片钳制技术。结果 灯盏花素以剂量依赖的方式增加Ik,0 0 1g·L-1灯盏花素使Ik 增大 4 4 6 % (0 0 1<P <0 0 5 ) ,0 0 2 g·L-1灯盏花素使Ik增大 6 0 3% (P <0 0 1) ,灯盏花素此作用经冲洗可部分消退。结论 灯盏花素能促进K+ 通道开放 ,促进K+

前列腺素E_1对豚鼠心室肌细胞ATP敏感K^+通道的影响

目的 从离子通道水平 ,探讨前列腺素E1(PGE1)对ATP敏感K+ (KATP)通道的作用。方法 膜片钳制技术全细胞记录模式。结果 PGE1可诱导KATP通道开放并呈浓度依赖关系。保持电位 - 40mV ,指令电位 +2 0mV ,持续时间 1s条件下 ,10 μmol·L-1PGE1使外向K+ 电流由给药前的 (2 2 7± 0 34 )nA增加到 (5 46± 0 34 )nA(n =6 ,P <0 0 1) ,增加了 (3 18± 0 2 3)nA。并且增加的钾电流可被KATP通道特异阻断剂Glibenclamide(10 μmol·L-1)抑制 ,抑制率是 6 3%± 7% (n =5 ,P <0 0 1)。

牛磺酸对低钙环境下豚鼠心室肌细胞I_(Ca)的影响

目的 观察在低钙环境下 ,牛磺酸对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流 (ICa)的影响。方法 应用全细胞膜片钳制技术。结果 低钙状态下 ,豚鼠心室肌细胞ICa减小 ,此时牛磺酸可促进Ca2 +内流 ,使ICa增加 (P 0 .0 1) ,此作用具有电压依赖性 ,对反转电位无明显影响。此作用随细胞外Ca2 +浓度的降低而有所增强 ,并且是可逆的。结论 牛磺酸能增加低钙状态下的心室肌细胞Ca2 +内流。

灯盏花素对豚鼠心室肌细胞I_(Ca)的影响

目的观察灯盏花素对豚鼠心室肌单细胞钙离子电流(ICa)的影响。方法采用全细胞膜片钳制技术。结果灯盏花素能使豚鼠心室肌细胞ICa减小,连续刺激后,对ICa的抑制作用加强,与给药前比较,差异显著(P<0.01);此作用具有明显的电压依赖性,在峰电流电压下作用最明显,而对其反转电位无明显影响;灯盏花素对ICa的作用随质量浓度升高而加强,在指令电压0 mV时,5、10和20 mg.L-1灯盏花素使ICa分别减小5.4%、22.9%和45.0%(P<0.01),且可以恢复;在不同的刺激频率下,灯盏花素均可使ICa减小,尤其对高频率刺激细胞产生的ICa作用更明显(P<0.05)。结论灯盏花素能抑制豚鼠心室肌细胞的Ca2+内流,此作用具有电压依赖性、质量浓度依赖性、药物使用-刺激频率依赖性和可恢复性。

链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞钙敏感外向钾电流的影响

目的 :研究链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜 K+ 电流的影响 ,以进一步揭示氨基甙类抗生素耳毒性的离子机制。方法 :全细胞膜片钳制技术。结果 :记录到 Ca2 + 敏感的外向 K+ 电流 [Ik(Ca) ];分别观察了 0 .1,1,10 ,10 0 ,10 0 0 μm ol/ L 链霉素对 Ca2 +敏感的外向 K+电流的影响。在指令电位 + 80 m V时 ,链霉素的抑制率分别为 0 ,(6 .72± 4.42 ) % ,(15 .5 4± 5 .43) % ,(18.0 2± 5 .32 ) % ,(30 .86± 11.2 1) %。结论 :链霉素以浓度依赖方式抑制 Ca2 +敏感的外向 K+电流 ,这可能是其急性耳毒性机制之一。

低温保存大鼠肝细胞外向钾电流的变化

应用全细胞膜片钳制技术观察了低温保存的大鼠肝细胞外向钾电流（Ｉｋ）的变化。结果表明，低温保存大鼠肝细胞的外向钾电流为５．０４±０．８２ｎＡ（ｎ＝１８），大于对照组肝细胞膜电流２．８５±１．２１ｎＡ（ｎ＝３２）（Ｐ＜０．０１）。

部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用

目的研究牛心细胞质部分纯化提取物及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)对大鼠心肌细胞膜L-型钙通道活性的调节作用。方法采用常规的蛋白提取方法制备牛心细胞质提取物,离子交换方法进行部分纯化。应用膜片钳制技术的细胞贴附和膜内向外记录模式记录大鼠心室肌细胞单通道钙电流,观察牛心细胞质部分纯化提取物和CaMKⅡ对"run-down"L-型钙通道活性的恢复作用。Western blot方法验证活性蛋白。结果膜内向外记录模式下,L-型钙通道出现"run-down"现象,活性下降至细胞贴附记录模式的(0.46±0.15)%;牛心细胞质部分纯化提取物使"run-down"的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(44.29±13.51)%(P<0.01),加入CaMKⅡ抑制剂KN-62(1μmol/L)后活性仅恢复至(1.30±0.94)%,与未加抑制剂组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot方法验证牛心细胞质部分纯化提取物中含有CaMKⅡ;基因重组融合蛋白法制备的CaMKⅡ也可将"run-down"后的钙通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(71.59±14.76)%(P<0.05)。结论牛心细胞质部分纯化提取物对"run-down"钙通道活性具有恢复作用,该作用可能与CaMKⅡ密切相关。

QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的影响

应用全细胞膜片钳制技术观察了QT村豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流（Ica）的影响。结果显示：QT能明显增加心室肌细胞的Ca2+内流，使Ica增大。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响。在指令电位0mV时，浓度为500mg·L-1、lg·L-1、2g·L-1的QT分别使Ica增加9．5％、29．3％和523％（分别P＜0．10、P＜0．05、P＜0．01），EC50约1g·L-1。QT对Ica的作用具有可复性。上述结果揭示；QT以电压依赖和浓度依赖的方式增加心肌细胞的Ca2+内流，此作用可能是其治疗充血性心力衰竭的机制之一。

顺铂抑制豚鼠耳蜗外毛细胞钙激活的钾电流

目的 研究顺铂对豚鼠耳蜗外毛细胞钙激活的钾电流作用。方法 豚鼠被迅速断头处死 ,暴露耳蜗 ,在解剖显微镜下去除耳蜗侧壁 ,经胰蛋白酶消化并轻轻吹打 ,以获得单离的豚鼠耳蜗外毛细胞。静置后在倒置相差显微镜下观察。应用膜片钳制技术从单离的豚鼠耳蜗外毛细胞获得钙激活的钾通道记录 ,并观察顺铂对它的作用。结果 结果表明该通道活动受到细胞外浓度为 10 -5mol·L-1的顺铂的抑制。

高血压病患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道研究

目的:研究高血压病患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的功能活动。方法:应用膜片钳制技术内面向外式单通道记录方法。结果:①人肠系膜动脉平滑肌细胞KCa开放具有电压依赖性。KCa通道电导在高血压组、正常组分别为191.4pS、197.7pS。胞内侧应用TEA可阻断通道。②增加浴液中Ca2+浓度(从0增至10-8、10-7、5×10-7、10-6mol/L),各组KCa开放概率(Po)均呈浓度依赖性增加,高血压组Po从0.016增至0.023、0.031、0.053、0.094,正常组Po从0.004增至0.023、0.041、0.072、0.184。通道平均开放时间延长,平均关闭时间缩短。③Ca2+浓度为0时,高血压组KCa开放概率明显高于正常组,在其它Ca2+浓度下高血压组KCa开放概率等于或低于正常组。结论:高血压病患者肠系膜动脉平滑肌细胞KCa的Ca2+敏感性较低,可能促进高血压的发生。

吡拉西坦对海马神经元钙激活钾通道的作用

目的 研究吡拉西坦对原代培养海马神经元钙激活钾通道 (KCa通道 )的作用 ,以揭示吡拉西坦抗缺血性脑损伤的电生理机制。方法 应用膜片钳制技术记录原代培养的海马神经元的单通道电流活动 ,经 p- CL AMP软件进行微机采样储存数据和数据的分析处理。结果 吡拉西坦对 KCa通道具有明显的激活作用 ,增加通道开放概率 ,缩短通道关闭时间 (P<0 .0 1)。结论 吡拉西坦可能通过激活

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响

目的探讨耳毒性药物顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响,了解顺铂耳毒性的离子机制。方法选择状态良好培养2～14d的耳蜗螺旋神经节细胞在电压钳制条件下记录的钾电流作为对照组,浴液中分别加入100,500,1000,5000μM不同浓度的顺铂溶液后记录的电流为实验组,观察其对钾通道电流电生理学特性的影响,并观察冲洗后电流的恢复情况。结果实验显示耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性受不同浓度顺铂溶液的影响,并具有浓度依赖性,表现在其活化动力学和电流幅度的改变。本实验中顺铂的50%的电流被抑制时的浓度(IC50)为294μM,冲洗后钾通道电流逐渐恢复。结论顺铂可以改变耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性,这种变化在短期内可逆,揭示其耳毒性的形成具有一定的离子机制。

人动脉平滑肌钙激活钾通道与遗传因素的关系探讨(英文)

目的 探讨高血压病 (Essentialhypertension ,EH)患者及正常血压者肠系膜动脉平滑肌钙激活钾通道 (Ca2 + activatedK+ channel ,Kca)的功能活动及其与遗传因素的相关性。方法 用膜片钳单通道记录技术记录胞内和胞外Ca2 + 对无EH家族史的正常血压者 (Nn 组 )、有EH家族史的正常血压者 (Nf 组 )、无EH家族史的EH患者 (En 组 )、有EH家族史的EH患者 (Ef 组 )肠系膜动脉平滑肌 (Mesentericarterialsmoothmus cle ,MASM)细胞的Kca开放概率 (Po)、平均开放时间 (To)、平均关闭时间 (Tc)及电流幅值 (Am)的影响。结果 内面向外式膜片下 ,Nf 组、Ef 组MASM细胞Kca的Po、To、Tc 与Nn 组和En 组比较 ,无显著性差异 ;细胞贴附式膜片下 ,当胞外Ca2 + 浓度≥ 1.8× 10 -3 mmol/L时 ,Nf 组和Ef 组的MASM细胞Kca的Po 分别低于Nn 组 ,En组 ,To 缩短和Tc 延长。结论 人MASM细胞Kca对胞内Ca2 + 的敏感性与遗传因素无关 ;人MASM细胞Kca对胞外Ca2 + 的敏感性降低与遗传因素有关 ,Kca对胞外Ca2 + 的敏感性降低可能是EH的发生机制之一。

家兔肺动脉平滑肌细胞的延迟整流钾电流及白花前胡有效成分Pd-Ia对此电流的作用

建立用胰蛋白酶和胶原酶分离制备家兔肺动脉单离平滑肌细胞的方法并以膜片钳制技术观察了此细胞延迟整流钾电流的基本特性及中药白花前胡有效成分Ｐｄ－Ｉａ的作用。结果表明：①将细胞钳制在－４０ｍＶ，当指令电位大于－４０ｍＶ时，可以记录到具时间及电压依赖性的延迟整流钾电流；②Ｐｄ－Ｉａ１０－６ｍｏｌ／Ｌ在指令电位为＋８０ｍＶ时，可以使延迟整流钾电流由给药前的（１．８±０．５）ｎＡ增加至（２．３±０．６）ｎＡ，提示Ｐｄ－Ｉａ可能具有钾通道开放作用。

人脐血红细胞膜的钙激活钾通道

作者应用膜片钳技术研究了人脐血红细胞电压依赖和钙活钾通道的电学特性。在细胞吸附膜片中，对称性140mM钾溶液条件下，该通道有一个28．6pS的斜率电导，同时表现出高度K＋选择性．实验发现通道对细胞内钙敏感，当膜电位变正或胞内Ca2＋从10－6M升高到10－5M时，通道开放的频率与时间增加。胞外应用TEA10mM能有效阻断通过电流。从该通道表现出的小电导、能被膜去极化和胞内Ca2＋升高所激活，能被TEA阻断和对K＋高度选择性这样一些特点，我们得出结论，这个通道类似于在其它不同组织上发现的钙激活钾通道．

大鼠肝细胞外向钾电流的实验研究

目的：研究大鼠肝细胞上外向钾电流。方法：全细胞膜片钳制方法观察大鼠肝细胞延迟外向钾电流（Ｉｋ）和瞬间外向钾电流（Ｉｔｏ）及去甲肾上腺素等对Ｉｋ的影响。结果：正常细胞外液条件下，大鼠肝细胞在保持电位－５０ｍＶ，＋１４０ｍＶ刺激电压时Ｉｋ为（２．８５±１．２１）ｎＡ。应用改变保持电位（－８０ｍＶ和－３０ｍＶ）的方法。初步区分Ｉｔｏ和Ｉｋ，Ｉｔｏ值为（１．３９±０．５８）ｎＡ。结论：去甲肾上腺素明显降低Ｉｋ。

镁对海马神经元钙激活钾通道的作用

目的 研究Mg2 +对海马神经元钙激活钾通道的作用 ,以揭示Mg2 +抗缺血性脑损伤的机制。方法 应用膜片钳制技术inside-out方式记录原代培养的海马神经元单通道电流活动 ,经p -CLAMP软件进行微机采样储存数据和数据分析处理。结果 Mg2 +在一定浓度范围内对海马神经元钙激活钾通道具有明显激活作用 ,增加通道开放概率 (Po) ,缩短通道关闭时间。结论 Mg2 +对海马神经元钙激活钾通道的激活作用可能为Mg2 +抗缺血性脑损伤的重要机制之一。

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电生理学特性的研究

目的:应用膜片钳技术记录小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的全细胞电流,了解电压依赖性离子通道的基本电生理学特性,并比较耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异。方法:应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的电极内液及阻断剂,在不同的刺激参数下记录耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的电压依赖性离子通道电流,并进行分析比较。结果:实验记录到了内向的钠电流、延迟整流钾电流、超极化激活内向阳离子通道电流及瞬时外向钾电流,并发现耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的延迟整流钾电流及瞬时外向钾电流的电生理学特性具有显著性差异(P<0.05)。结论:实验记录到的各种离子电流数据表明耳蜗螺旋神经节细胞具有完成动作电位的形成、传导并对其功能进行调节的离子通道基础;耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异有助于听觉的形成过程。