日本血吸虫22.6ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达

为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。

中药对肾脏足细胞细胞骨架及裂孔隔膜相关蛋白的研究进展

肾小球内有三种固有细胞：系膜细胞、内皮细胞、足细胞。不同的病因可导致不同固有细胞的损伤，在临床上表现为不同类型的。肾小球疾病。其中足细胞受损后，临床主要表现为蛋白尿。蛋白漏出是肾小球疾病的常见表现，反过来也是加速。肾小球硬化的一个重要因素。近年来对足细胞生物学研究的深入，足细胞已被认为是参与各种原发或继发性肾小球疾病进展的关键细胞。本文对近5来中医药对足细胞的治疗研究进行汇总，希望为中医药对足细胞的研究提供思路。

华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumental protein ofClonorchis sinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。

新型隐球菌与荚膜相关蛋白基因

隐球菌病是一种可在人和多种动物中发生的严重的真菌病，通常多由存在于泥土中的腐生物、鸽子的排泄物和环境中其他物质中的新型隐球菌所引起。本病属于外源性感染，经呼吸道侵入人体，而由肺经血行播散时可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。据报道在HIV高度感染的患者中，隐球菌病的患病率是6％～8％；在肾移植受者中．患隐球菌病的终身危险率接近10％。

用新生隐球菌荚膜相关蛋白10基因mRNA水平评估抗真菌药物疗效

目的定量检测新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,CN)的荚膜相关蛋白10(capsule associated protein 10,CAP10)基因mRNA,探索将其用于隐球菌性脑膜炎抗真菌药物疗效评估的可行性。方法构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10并制作标准曲线;建立荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)反应体系并对其进行评价。利用建立的FQ-PCR体系检测11例氟康唑联用5-氟胞嘧啶治疗、9例两性霉素B联用5-氟胞嘧啶治疗患者治疗前后脑脊液(CSF)CAP10 mRNA拷贝数的变化,并结合临床资料进行分析。结果建立的FQ-PCR体系适合于CAP10 mRNA拷贝数的测定。两性霉素B联合5-氟胞嘧啶治疗组CAP10 mRNA的拷贝数的log值治疗前为3.43±0.84,治疗后下降为2.35±0.85(P<0.05);氟康唑联合5-氟胞嘧啶治疗组治疗前为2.65±1.24,治疗后下降为1.84±1.07(P<0.05)。2组患者临床症状均明显改善。结论构建的新生隐球菌CAP10 mRNA的FQ-PCR定量检测体系适合于脑脊液标本的检测,为新生隐球菌感染患者抗真菌药物疗效的判断提供了新的依据。

鲍曼不动杆菌生物膜相关蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备鲍曼不动杆菌生物膜相关蛋白(biofilm-associated protein,Bap)单克隆抗体,并初步建立鲍曼不动杆菌的免疫学检测技术。方法 化学合成Bap基因序列,经原核系统表达及亲和层析技术纯化目的蛋白后,获得重组蛋白Bap-His。将重组蛋白Bap-His免疫2只雌性BLAB/c小鼠的脾部细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选获得阳性杂交瘤细胞株,用其制备单克隆抗体,进行SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。基于间接ELISA法,采用获得的单克隆抗体建立鲍曼不动杆菌的免疫学检测技术,并验证其特异性及最低检出限。结果 共筛选出2株杂交瘤细胞,制备获得mAb-2F和mAb-7E 2株单克隆抗体,纯度均达90%以上,均可与鲍曼不动杆菌天然蛋白发生特异性结合。采用2株单克隆抗体建立的免疫学检测技术仅可用于检测鲍曼不动杆菌,无法检测其他呼吸道病原体,最低检出限分别达1.6×10^(5)和8.0×10^(4)cfu/mL。结论 制备的Bap单克隆抗体具有较高纯度,可为Bap相关功能研究提供生物材料;建立的鲍曼不动杆菌免疫学检测技术具有良好的特异性及敏感性,为鲍曼不动杆菌的检测提供了技术支持。

膜相关环指蛋白7在上皮性卵巢癌组织和细胞中的表达及作用机制研究

目的:探究膜相关环指蛋白7(MARCH7)在上皮性卵巢癌(EOC)组织和细胞中的表达及作用机制。方法:选取就诊且经手术治疗的患者32例,包括EOC患者16例和卵巢组织正常患者16例,收集EOC患者和卵巢组织正常患者的卵巢组织标本,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MARCH7 mRNA表达水平。构建过/低表达MARCH7的上皮性卵巢癌细胞(SKOV3、CAOV3)后,采用Transwell实验观察MARCH7对EOC细胞迁移和侵袭能力的影响,采用Western blot检测过/低表达MARCH7的EOC细胞上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、锌指转录因子1(Snail1)、锌指转录因子2(Slug)蛋白表达。结果:卵巢癌组织MARCH7 mRNA表达水平高于正常卵巢组(P<0.05)。在SKOV3和CAOV3细胞中,正常对照组与低表达对照组和过表达对照组细胞迁移和侵袭能力,以及MARCH7和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail1和Slug蛋白表达比较无统计学差异(均P>0.05);与低表达对照组比较,沉默MARCH7的细胞迁移和侵袭能力降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Snail1和Slug蛋白表达降低(均P<0.01);与过表达对照组比较,过表达MARCH7的细胞迁移和侵袭能力升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Snail1和Slug蛋白表达升高(均P<0.01)。结论:MARCH7在EOC组织和细胞中呈高表达,可能通过促进EOC细胞的EMT过程,增强EOC细胞的侵袭和迁移能力。

膜相关锌指蛋白5在线粒体质量控制中的作用研究进展

线粒体质量控制对于线粒体网络的稳态和线粒体功能的正常发挥具有重要意义。膜相关锌指蛋白5(membrane-associated RING-CH 5,MARCH5/mitochondrial ubiquitin ligase,MITOL/RNF153)作为一种E3泛素连接酶,同时参与调节线粒体功能、线粒体动力学和线粒体自噬等重要生物学过程。本文重点阐述线粒体外膜蛋白MARCH5在调控线粒体功能、融合与分裂以及自噬中的作用及机制,并对MARCH5与运动的关系进行展望,以期为靶向MARCH5的药物和/或运动干预手段的开发和应用提供有益参考。

泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

新型隐球菌荚膜相关蛋白10基因mRNA测定的诊断价值

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种担子菌纲真菌，它广泛分布于自然界，可存在于土壤、鸽粪和桉树中，也可存在于人体体表。近年来，随着器官移植术的广泛开展、免疫抑制剂的广泛应用以及免疫缺陷综合征患者的不断增加，新型隐球菌引起的感染日益增多。Chang和Kwon—Chung分离、鉴定和定位了新型隐球菌的荚膜相关蛋白（CAP），其中CAP10基因对荚膜的形成是必不可少的。

HCC细胞膜相关蛋白的快速鉴定

为快捷、特异地鉴定HCC(hepatocellular carcinoma,人肝细胞癌)细胞的膜相关蛋白,用DOC(脱氧胆酸钠)对贴壁培养的HCC细胞系HepG2进行处理,使细胞皱缩并脱离培养面,收集未脱离的HepG2膜相关蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,最后应用ESIQUAD-TOF MS(electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry),成功鉴定出包括热休克蛋白90α、玻璃体粘连蛋白前体、层粘连蛋白α5亚单位前体、胶原蛋白前体、鳞状细胞癌T细胞识别抗原-3等35个蛋白质,其中膜相关蛋白18个,所占比例超过50%。

脂肪膜细胞相关蛋白对3T3-L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响

目的观察APMAP对脂肪细胞糖代谢和细胞分化的影响,并分析其对于糖代谢的作用机制。方法通过慢病毒干预3T3-L1脂肪细胞APMAP表达,观察对3H-葡萄糖的摄取并进行油红O染色定量分析脂肪细胞分化程度,检测培养上清中甘油和游离脂肪酸(NEFA)浓度以及细胞内三酰甘油(TG)的含量。脂肪细胞分化相关基因,过氧化物体增殖剂活化受体γ(PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白A(C/EBPα)mRNA的表达通过实时定量PCR检测。结果APMAP过表达组和沉默组葡萄糖摄取率分别为正常对照的176.8%和67.4%,同时过表达组油红O染色OD值明显高于沉默组和对照组(P<0.01)。APMAP过表达组明显促进脂肪细胞分化及PPARγ和C/EBPαmRNA表达。结论APMAP表达量直接影响葡萄糖摄入量,过表达的APMAP能促进细胞内脂质的积聚,促进细胞分化,对于脂肪细胞糖代谢有着重要调控作用。

溶酶体相关4次跨膜蛋白质基因多态性与肝癌易感性的关系

目的：探讨溶酶体相关4次跨膜蛋白质B（lysosome-associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B）基因多态性与肝癌易感性的关系．方法：应用病例对照研究方法，收集190例肝癌患者、190例慢性乙型肝炎患者、175例健康献血者全血，分离白细胞，提取基因组DNA，采用特异性引物PCR方法，扩增LAPTM4B第一外显子5′UTR内的部分序列，对三组人群进行分析研究．x^2检验分析肝癌组与对照组LAPTM4B的基因多态性和其他相关因素的相关性．结果：LAPTM4B等位基因在三组观察对象中的分布，^＊1和^＊2在健康对照组的频率分别是75．71％和24．29％，慢肝组73．16％和26、84％，肝癌组中66．84％和33.45％，三组比较等位基因分布频率有统计学意义，健康对照组与肝癌组比较有统计学意义（x^2=6．979，P=0．008）．LAPTM4B的基因型LAPTM4B1^＊1型、LAPTM4B^＊1／2混合型和LAPTM482^＊2型在肝癌组中的频率分别是37.9％、57.9％和4．2％、慢肝组50．5％、45．3％和4．2％、健康对照组56．6％、38.3％和5．1％，三组间三种基因型分布频率比较有统计学意义（x^2=14．854，P〈0．005）.结论：基因型^＊1／2和等位基因^＊2可能与肝癌的发生有关．

电针对绝经后骨质疏松症模型大鼠肠黏膜维生素D膜相关性快速反应类固醇结合蛋白表达的影响

目的通过观察去卵巢骨质疏松模型大鼠肠黏膜1,25维生素D_(3)膜相关性快速反应类固醇结合(membrane-associated rapid response steroid-binding,1,25D_(3)-MARRS)蛋白表达,以及血清甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)、1,25-二羟基维生素D_(3)[1,25(OH)_(2)D_(3)]、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)的变化,探讨电针治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。方法将32只3月龄SD雌性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组及电针组,每组8只。模型组和电针组采用切除大鼠双侧卵巢的方法制备绝经后骨质疏松症模型,假手术组仅切除卵巢周围少量脂肪组织,空白组不做任何处理;造模后电针组进行电针干预。各组大鼠均进行骨密度检测,血清钙、PTHrP、1,25(OH)_(2)D_(3)、OPG、RANKL检测,以及肠黏膜1,25D_(3)-MARRS蛋白的表达检测。结果与空白组和假手术组比较,模型组大鼠股骨、胫骨骨密度明显下降(P<0.05)。与空白组和假手术组比较,模型组大鼠血清钙、PTHrP及1,25(OH)_(2)D_(3)水平明显降低(P<0.05,P<0.01),OPG/RANKL比值明显降低(P<0.01),且肠黏膜1,25D_(3)-MARRS蛋白表达减少(P<0.01)。与模型组比较,电针组股骨、胫骨密度升高(P<0.05,P<0.01),血清钙、PTHrP、1,25(OH)_(2)D_(3)水平明显升高(P<0.05,P<0.01),OPG/RANKL比值明显升高(P<0.01),肠黏膜1,25D_(3)-MARRS蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论电针可通过提高血清钙、PTHrP及1,25(OH)_(2)D_(3)含量,提高OPG/RANKL比值,增加肠黏膜1,25D_(3)-MARRS蛋白表达,从而改善肠道钙吸收,提高去卵巢骨质疏松症大鼠的骨密度,最终达到防治骨质疏松的作用。

膜相关环状蛋白在肿瘤中作用的研究进展

膜相关环状蛋白(MARCH)是一类E3泛素化连接酶家族,主要参与蛋白泛素化、抗原提呈、胞内转运、精子发生等细胞功能,并可通过调控MHC、CD86等分子的表达在过敏性哮喘、多器官功能障碍综合征、肿瘤等疾病的发生发展中起到重要作用。阐明MARCH蛋白在肿瘤中的作用机制,对了解MARCH蛋白复杂的作用和制定进一步研究策略具有重要意义。

柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白EtMA1和EtMA2的克隆及序列分析

为筛选柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)候选疫苗分子,注释并克隆E.tenella入侵相关蛋白EtMA1和EtMA2的编码基因,并对其序列结构进行分析。本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释获得EtMA1和EtMA2的编码基因序列,以E.tenella(广东株)裂殖子总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增获得EtMA1和EtMA2的开放阅读框(ORF)序列。利用在线生物信息学软件分析EtMA1和EtMA2的序列结构及与顶复门其他虫属的进化关系。结果显示,EtMA1和EtMA2ORF全长分别为1 617和1 725bp,分别编码全长为539个氨基酸和575个氨基酸的多肽片段。二者与TgAMA1相似性分别为30%和26%。EtMA1和EtMA2同属于E.tenella顶膜抗原超家族蛋白,可能在虫体对宿主的入侵过程中起着关键作用,这也为防控鸡球虫病提供了新的候选疫苗分子。

高密度脂蛋白对血小板ɑ 颗粒膜糖蛋白及CD63表达的影响

目的研究高密度脂蛋白(HDL)对凝血酶刺激的人血小板α颗粒膜糖蛋白(CD62P或P-选择素)、溶酶体膜糖蛋白(CD63)表达的影响。方法 3组等体积手工制备的洗涤血小板分别加入0.5、1和10U/mL的凝血酶(低、中、高凝血酶组),另外3组同样含量的凝血酶加入37℃孵育15min的HDL,分别为低、中、高复合组。同时37℃环境下孵育10min,以流式细胞仪检测各组CD62P、CD63的表达。结果低、中、高复合组CD62P表达率分别为11.55%±1.34%,17.19%±0.17%,19.79%±0.32%,均低于相应凝血酶组的18.14%±1.50%,26.24%±0.77%,80.38%±5.66%(均P<0.01),低、中、高复合组CD63表达也低于相应的凝血酶组即(2.92%±0.22%、4.20%±0.98%,5.12%±0.09%vs8.09%±0.48%、14.15%±1.39%、24.48%±1.71%,均P<0.01)。低、中复合组血小板CD62P、CD63抑制率均低于高复合组(均P<0.05)。结论在体外,HDL抑制了凝血酶刺激的血小板α颗粒膜糖蛋白和溶酶体膜糖蛋白的表达。

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株B亚型Gag和Env蛋白在大肠杆菌中的表达

将中国流行株 型人免疫缺陷病毒 ( HIV-1 ) B亚型 gag基因和 env基因定向插入原核表达载体p ET2 8a和 p ET2 8c,获得重组表达质粒 p ETG、p ETM1、p ETM2和 p ETM3。将 p ETG转化表达宿主菌 BL2 1( DE3 ) plys S,用 IPTG诱导 ,SDS-PAGE电泳分析有重组蛋白表达。该蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加 ,4 h达到最大值。凝胶扫描结果显示 ,该蛋白表达量占菌体总蛋白的 1 0 .3 %。Western blotting检测 ,该重组蛋白可与中国流行株 HIV-1 B亚型阳性血清发生特异反应。重组表达质粒 p ETM1、p ETM2和 p ETM3仅在蛋白印迹中与 gp1 2 0单抗发生特异性反应而出现特异显色带 ,SDS-PAGE电泳分析未见表达蛋白带。

人参皂苷Rg3对骨质疏松大鼠骨代谢及肠钙吸收功能的影响

目的:探究人参皂苷Rg3对骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨代谢及肠钙吸收功能的影响。方法:60只SPF级雌性Wistar大鼠,按照随机数字法分为空白组、模型组、阳性组、实验组,每组大鼠各15只。除空白组外,其他大鼠均采用去势(OVX法)法制备OP大鼠模型。造模成功后,空白组及模型组生理盐水灌胃[10 mL/(kg·d)],阳性组给予阿仑膦酸钠维D3灌服(每周6.25 mg/kg),实验组给予人参皂苷Rg3[80 mg/(kg·d)]灌胃治疗,连续干预治疗12周。检测各组股骨、胫骨骨密度变化,酶联免疫法检测大鼠血清中骨保护素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)、Ⅰ型前胶原氨基末端肽(procollagen typeⅠNterminal propeptide,PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)、I型胶原交联C-末端肽(TypeⅠcollagen carboxy-terminal peptide,CTX-I)含量变化;原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法分析各组肠黏膜组织细胞凋亡情况;Masson法分析各组肠黏膜组织纤维病理改变;免疫组化法检测各组肠黏膜组织中维生素D膜相关快速反应结合蛋白(membrane-associated rapid response steroid-binding,1,25-D3-MARRS)蛋白表达;蛋白免疫印迹法及RT-PCR法检测各组Jagged1、Notch1、Hes1蛋白及mRNA表达水平。结果:大鼠造模后股骨、胫骨骨密度明显下降,血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量明显变化(P<0.05);肠黏膜组织病理发生明显改变,组织纤维化增强,细胞凋亡程度增加;肠黏膜组织1,25-D3-MARRS蛋白表达降低(P<0.05)。治疗后与模型组对比,阳性组及实验组大鼠股骨、胫骨骨密度明显升高,血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量明显改善(P<0.05);肠黏膜组织病理发生明显改善,纤维化降低,细胞凋亡程度降低;肠黏膜组织中Jagged1、Notch1、Hes1蛋白及mRNA表达明显改善(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg3能够提高OP大鼠骨密度,减轻肠黏膜组织细胞凋亡及组织纤维化,增加肠黏膜1,25D3-MARRS蛋白表达,改善肠道钙吸收。