膜结合型TNF-α基因转导人胃癌细胞株的建立及其生物学特性研究

本研究利用逆转录病毒载体LXSN构建了插入突变的膜结合型TNF-α基因的重组逆转录病毒载体，将重组载体及空载体导入包装细胞CRIP．筛选G418抗性克隆。测定病毒滴度均为1×10^4CFU／ml，并转入胃癌细胞MGC-803．经筛选分别获得抗性克隆MGC-803^T及MGC-803^T,经Southern杂交证实目的基因已整合在MGC-803^T细胞基因组中。MGC-803^T对L929细胞有杀伤作用．而对照细胞无杀伤作用。MGC-803^T细胞的形态，体外增殖率无明显改变。裸鼠体内接种结果表明，与对照组相比，MGC-803^T细胞在裸鼠体内的生长受到明显抑制，表现为肿瘤发生延缓．肿瘤重量明显减轻。上述结果表明．逆转录病毒介导的突变型膜结合型TNF-α基因可在人胃癌细胞中获得有效表达．并能改变其生物学特性。

膜结合型TNF-α基因在人胃癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

TNF-α是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子．它有二种形式，一种是26kD膜结合型，另一种是17kD分泌型，二者在体外均有细胞毒活性。我们利用逆转录病毒载体LXSN构建了插入突变的膜结合型TNF-α基因的重组逆转录病毒载体。用Lipofectin将逆转录病毒载体及重组逆转录病毒载体引入包装细胞CRIP，

前列腺癌PC-3M细胞株膜结合型唾液酸酶的活性测定与基因表达

目的 :研究前列腺癌 PC- 3M细胞株膜结合型唾液酸酶 ( hm SD)的活性和基因表达。方法 :收集指数生长期的 PC- 3M细胞 ,匀浆后离心取上清 ,与底物共同孵育 ,以 TBA显色反应检测所生成的唾液酸 ,计算唾液酸酶活性 ;应用 RT- PCR方法检测 hm SD的 m RNA表达。结果 :在 PC- 3M细胞株可检测到 hm SD活性及其 RNA的表达。结论 :PC- 3M细胞在基因和蛋白水平有 hm SD的表达。

比较跨膜型与分泌型TNF-α在体内的杀瘤效应

目的:比较分泌型和跨膜型TNF-α在体内抗瘤作用的异同.方法:在肿瘤局部直接注射3种TNF-α(野生型TNF-α重组体、跨膜型及分泌型TNF-α突变体)基因,观察其抗瘤效应 结果:3种TNF-α均能有效表达。并具明显抑瘤效应,跨膜型TNF-α突变体对早期肿瘤的仰制效应明显高于其它2种TNF-α(P<0.01),而野生型TNF-α对中肿瘤的抗瘤效应则最佳.此外,注射3种TNF-α裸DNA均未观察到明显副作用,结论:分泌型和跨膜型TNF-α抑瘤机制可能下同,裸DNA直接用于细胞因子基因治疗较安全。

人 TNF-α 分泌型、膜型和膜稳定型重组体的构建、表达及杀瘤效应研究

通过用ＩＬ－２信号肽编码序列置换ＴＮＦ前导肽编码序列，构建出一种在真核细胞中仅产生分泌型ＴＮＦ的重组体；通过缺失二型ＴＮＦ转换的酶解部位而构建出跨膜表达的膜稳定型ＴＮＦ重组体，并建立分别只表达分泌型或膜型及可同时表达两型ＴＮＦ的真核细胞株，比较二型ＴＮＦ的杀瘤效应。结果显示，膜型ＴＮＦ主要经效－靶细胞间直接接触发挥胞毒效应，杀瘤谱比分泌型ＴＮＦ广；ＴＮＦ的分泌型和膜型具有协同效应。通过基因直接注射方式，使膜型及膜稳定型ＴＮＦ重组体稳定表达小于鼠体内，为膜型ＴＮＦ转基因应用奠定了基础。

膜结合型前列腺素E合成酶1及其表达与肿瘤相关性的研究进展

膜结合型前列腺素E合成酶1(membrane-associated prostaglandin E synthase-1,mPGES-1)是前列腺素(prostaglandin,PG)E2生物合成过程中重要的终端限速酶,与环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)功能性偶联参与机体多种生理及病理过程。近年来研究发现,mPGES-1在多种肿瘤组织中过度表达,与肿瘤的发生、发展密切相关。抑制mPGES-1的活性能有效降低PGE2的产生,同时能避免非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)及COX-2特异性抑制剂引起的心血管方面的不良反应,是一个比COX-2更理想、更安全的防治肿瘤的药物开发新靶点。本文就mPGES-1的分子生物学特征、与肿瘤发生和发展的相关性及其抑制剂的研究进展作一综述。

膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染

目的 :研究膜结合型肿瘤坏死因子α(TNFα)在基因转染中的特点及其在肿瘤基因治疗中的作用等特性。方法 :用反转录病毒为载体 ,将含有突变的膜结合型TNFα的质粒 ,用lipofectin法转入包装细胞株crip细胞。又用收集到的病毒上清感染人乳腺癌细胞MDA2 31,采用G418筛选 ,DNA印迹法和聚合酶链反应方法鉴定该基因转染的结果。结果 :经上述方法鉴定表明该外源基因已成功转染人乳腺癌细胞中 ,为进一步研究膜结合型TNFα的功能奠定了基础。结论 :经初步研究表明 ,含有膜结合型肿瘤坏死因子的质粒可以通过lipofectin法成功导入crip细胞 。

膜结合型透明质酸酶PH-20 mRNA在消化道肿瘤表达的意义

目的研究膜结合型透明质酸酶(PH-20)mRNA表达与消化道肿瘤侵袭能力及淋巴结转移的关系,探讨其预测肿瘤侵袭危险度的意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测59例消化道肿瘤患者的原发癌、癌旁组织、淋巴结转移癌(其中13例)及4例消化道良性病变和各种细胞系(SGC-7901、BGC823、LS-174-T、HCT8、95-D、A549、HFL、HEPG2、L-02)中PH-20mRNA的表达水平。结果PH-20mRNA在上述组织中均有表达,消化道原发癌和淋巴结转移癌均明显高于癌旁组织(P<0.05)。消化道肿瘤PH-20mRNA表达与肿瘤浸润程度有关,浸润性肿瘤的PH-20mRNA表达量高于浅表性肿瘤(P<0.01)。结论PH-20mRNA表达改变可能与消化道肿瘤的发展有关,高表达PH-20mRNA的肿瘤细胞具有高侵袭潜能。

重组膜型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST-TNF融合基因的构建

目的 :构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)的融合基因表达载体。方法 :用RT PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段 ,定向克隆到质粒 pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX 4T 3中GST下游。结果 :从激活的单核细胞中扩增出70 0bp左右的膜型TNF基因 ;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论 :建立了重组膜型TNF的GST融合表达及纯化优势 ,为进一步定点突变 ,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF 。

膜稳定型TNF突变体的构建、表达及活性研究

目的 :TNF α可以分泌型 (S TNF)及其前体膜型 (M TNF)两种活性形式同时存在于体内。为膜型TNF的转基因应用 ,构建一种可表达于胞膜而不被酶解的膜稳定型TNF重组体 (mTNFm)。方法 :在克隆M TNFcDNA的基础上 ,删除两型TNF转换酶酶解部位的编码序列 ,构建出mTNFm并测序验证 ;建立只表达膜型TNF的真核细胞株。结果 :Westernblot分析及活性测定结果表明 ,mTNFm不再发生酶切转换且只通过效 靶细胞间直接接触发挥胞毒效应。通过基因直接注射方式 ,使mTNFm稳定表达于小鼠体内。结论

转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应

目的 :比较跨膜型和分泌型TNF α在体内的抗瘤效应。方法 :将 3种TNF α基因 (分泌型TNF α突变体 ,S TN Fm、跨膜型TNF α突变体 ,TM TNFm和野生型TNF α,Wt TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH/3T3 ;并用Southern印迹、RT PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法 ,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性 4个方面对转染细胞进行检测鉴定。在小鼠接种肿瘤细胞的第 3天 ,于接种部位分别皮下注射表达TNF α及其突变体的NIH3T3细胞 ,效 /靶比为5∶1或 1∶1 ,观察这 3种TNF α的体内抗瘤效应。结果 :NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体。在体外 ,NIH3T3/TM TNFm的固定细胞、NIH3T3/S TNFm的上清、NIH3T3/Wt TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H2 2。在体内 ,当效 /靶比为 5∶1时 ,注射NIH3T3/TM TNFm的抑瘤效果最强 ;而当效 /靶比为 1∶1时 ,则NIH3T3/S TNFm的疗效最好。此外 ,在过继治疗期间未见明显副作用。结论 :上述结果提示跨膜型和分泌型TNF α均可在体内有效杀瘤 ;但如效 /靶比适当 ,TM TNF α显示的杀瘤效应较S TNF

MHBs^t167基因转染对肾小管上皮细胞膜结合型补体调节蛋白表达的影响

补体激活导致肾组织免疫损伤是肾脏疾病的重要发病机制，而肾脏固有细胞可表达一系列补体调节蛋白对其激活进行限制。肾脏是乙型肝炎病毒（HBV）感染的主要靶脏器之一，其中肾小管上皮细胞尤易被感染。病毒感染与宿主细胞应答间的关系极为复杂，HBV-DNA与宿主DNA整合的过程中可发生基因重排，编码HBx、LHBs和MHBs^1等反式激活因子，进而活化多种转录因子和原癌基因启动子，参与感染后的炎性反应。以往研究表明乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）患者肾小管上皮细胞中可检测到HBV—DNA，并且大多为整合型。

基于mPGES-1表达调控的药物筛选模型的建立

聚合酶链式反应扩增mPGES-1上游调控序列并插入到已预先在pGL3-Basic载体的Sal Ⅰ位点插入真核筛选基因新霉素抗性基因（neomycin）形成的质粒pGL3B—neo中，构建重组报告基因载体pGL3B-neo／mPGES-1，转染人肺癌细胞A549，通过G418筛选，建立了稳定的mPGES-1表达下调剂筛选细胞株SPGES1。通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化筛选人mPGES．1表达下调剂，并优化了其筛选条件，优化的条件是每孔细胞接种数目为1×10^4-3×10^4个，溶剂DMSO终浓度为1％，底物用量为20μL。利用该模型可有效地进行人mPGES-1表达下调剂的筛选。

膜结合型 TNF-α与T细胞功能

膜结合型 Ｔ Ｎ Ｆα（ｍ Ｔ Ｎ Ｆα） 不仅是分泌型 Ｔ Ｎ Ｆα（ｓ Ｔ Ｎ Ｆα） 的前体， 也是一种重要的膜结合型细胞因子。ｍ Ｔ Ｎ Ｆα是 Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ８０ 的生理活化物， 且可通过同时激活 Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ６０ 和 Ｔ Ｎ Ｆ Ｒ８０ 使靶细胞应答增强。ｍ Ｔ Ｎ Ｆα可以表达于 Ｔ 细胞表面并参与其增殖、分泌、凋亡、免疫调节和细胞毒等多种功能。

转CmTreⅡ基因水稻RNAi效应的室内和田间抗性及遗传性鉴定

本研究采用农杆菌介导的遗传转化技术,将CmTreⅡ(膜结合型海藻糖酶基因一个靶位点)导入粳稻中花11号中,利用CmTreⅡ-dsRNA(含有膜结合型海藻糖酶基因一个靶位点的双链RNA)的沉默效应,沉默稻纵卷叶螟的膜结合型海藻糖酶,最终获得一批抗虫性较好的转基因纯合株系。研究中进一步检测了这些株系的室外卷叶率、白叶率以及室内抗虫性。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测转基因水稻室内抗虫性CmTre2基因的相对表达量。通过RT-PCR技术检测了转CmTreⅡ基因水稻的遗传性。结果显示:在室外抗虫性试验中,稻纵卷叶螟对水稻的取食量明显下降,转CmTreⅡ基因水稻的卷叶率和白叶率分别为13.40%和12.47%,相比对照组分别下降了11.32%和10.10%;在室内抗虫性试验中,RT-q PCR检测结果表明,稻纵卷叶螟在取食转CmTreⅡ基因水稻的96 h后,CmTre2基因的相对表达量比对照组下降了29.00%;7 d后,实验组的死亡率为56.67%,相比对照组增加了46.67%。在遗传性试验中,检测发现转CmTreⅡ基因水稻的遗传性良好。因此本研究成功鉴定了转CmTreⅡ基因水稻对稻纵卷叶螟的抗虫性以及遗传性。

脂多糖诱导黏蛋白MUC5AC表达上调机制的研究进展

一、黏蛋白（Muein，Muc）和脂多糖的生化特性及作用MUC广泛分布于机体各组织黏膜上皮表面，对黏膜起润滑、保护的作用。MUC的分布有组织、器官和细胞特异性。目前已经报道的有20余种[1-4]。MUC是由其多肽基因（Mucgene）编码而成的，根据MUC存在形式的不同可将其分为两类：分泌型和膜结合型。