肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学研究的可行性探讨

学术背景:肝再生是关系到肝移植、肝切除的重要病理生理过程,部分肝切除术后肝再生过程涉及血管新生的证据已经得到证实。目的:回顾肝再生的研究背景,综合分析开展肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学研究的可行性。检索策略:由熊力、李选文联机检索CHKD(www.chkd.cnki.net)和PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)数据库1994-01/2007-07有关肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学方面的文献,关键词(中文或其他语言)为"肝再生;肝窦内皮细胞;亚细胞蛋白质组;膜蛋白;肝移植"。获得相关中英文文献64篇,初筛后排除研究目与课题无关及内容重复的研究,保留39篇文献进一步分析。未发表的文献存档备用。文献评价:①文献来源情况:随机对照试验15篇,循证医学系统综述5篇,汇总分析14篇,经验交流5篇。②评价人:熊力。资料综合:有关肝再生的信号通路研究较多,目前认为存在两条通路,但蛋白质层面的机制尚待研究。肝窦内皮细胞是具有重要功能的非实质细胞,然而有关肝窦内皮细胞在肝再生中作用的研究较少,也未见关于肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的研究报道。结论:目前有关肝再生过程中肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的研究报道极少。作者首次提出肝窦内皮细胞可能是肝再生瓶颈的假想,认为开展肝窦内皮细胞膜蛋白质组学的相关研究对于肝切除、肝移植具有重要意义。

外源突变型p53和潜伏膜蛋白1基因在转基因鼠不同器官组织中的表达

目的:观察转基因小鼠鼻腔、鼻咽、肺、食道、胃、大肠、肝、肾、脾中外源突变型p53m t和潜伏膜蛋白1基因的表达情况。方法:实验于2005-03/04在湖南中医学院中西医结合系基础研究室完成。选取4月龄转p53m t和潜伏膜蛋白1基因F0代小鼠1只,以正常同龄未转基因C57BL/6J小鼠4只作为对照。采用免疫组化分别检测转基因鼠和对照鼠鼻腔、鼻咽、肺、食道、胃、大肠、肝、肾、脾中p53m t和潜伏膜蛋白1基因的表达强度,用图像分析系统测定阳性反应物的平均灰度值。系统设定白色最大灰度为256,黑色最小灰度为0。灰度值越小,代表阳性反映程度越高。结果:实验纳入转基因鼠1只,对照鼠4只,均进入结果分析。①蛋白质阳性表达信号的定位分布:转基因鼠p53m t和潜伏膜蛋白1基因的免疫组化阳性信号均为棕黄色的颗粒或斑块,表达量高,p53m t蛋白绝大部分分布于细胞膜和胞浆内,少数位于细胞核中。对照鼠p53mt蛋白在组织中呈弱表达,潜伏膜蛋白1的蛋白阳性信号主要位于上皮细胞的细胞膜和胞浆中。②转基因鼠和对照鼠不同组织部位中p53m t基因表达的平均灰度值:转基因鼠食道、肝、脾中平均灰度值较高(131.75±17.25,135.15±13.14,139.42±11.55),在鼻腔黏膜、鼻咽组织、大肠中平均灰度值较低(96.61±12.43,109.26±9.90,109.45±6.72)。除了胃、脾外,各组织部位与对照鼠比较均有显著差异(P<0.05)。③转基因鼠和对照鼠不同组织部位中潜伏膜蛋白1基因表达的平均灰度值:转基因鼠鼻咽部平均灰度值最低(106.75±19.57),其次为鼻腔、食道、肺、胃,而在大肠、肝、脾中表达水平较高(152.29±12.17,134.98±17.79,158.35±10.75)。除鼻腔、大肠、肝、脾外,各组织部位中潜伏膜蛋白1基因的表达水平与对照鼠比较均有显著差异(P<0.05)。④转基因鼠不同组织部位中p53mt基因与潜伏膜蛋白1基因表达水平的相关性分析:转基因鼠鼻腔黏膜、鼻咽组织、食道、肺、胃、大肠、肝、肾、脾中潜伏膜蛋白1基因表达水平和p53m t基因表达水平无相关性(相关系数｜r｜分别为0.744,0.459,0.589,0.722,0.258,0.252,0.337,0.111,0.209)。结论:外源突变型p53m t基因在转基因鼠鼻腔、鼻咽和大肠中表达水平较高,潜伏膜蛋白1基因在鼻咽组织中表达呈最高。两种基因在不同器官组织部位的表达均存在显著性差异,尤以潜伏膜蛋白1基因表达的组织特异性较强,但两种基因的表达不存在相关性。

长链非编码RNA RP11-770J1.3和跨膜蛋白25对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-770J1.3和跨膜蛋白25(TMEM25)对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响。方法:利用实时定量PCR检测lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在人乳腺癌细胞MCF-7和紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)中的表达。在MCF-7/PR中转染lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的干扰片段,磺酰罗丹明B法检测MCF-7/PR对紫杉醇药物敏感性的变化,并运用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测多药耐药相关蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、多药耐药基因1(MDR1)及其编码产物P-gp mRNA和蛋白水平的改变。结果:lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在MCF-7/PR中表达上调(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组和紫杉醇阴性对照组比较,干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的药物敏感性,并下调耐药相关基因MRP、BCRP、MDR1及其编码产物P-gp的表达(均P<0.05);与单独干扰lncRNA RP11-770J1.3或TMEM25比较,同时干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的作用更加明显(P<0.05)。结论:MCF-7/PR中lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达上调,联合干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的敏感性。

乙型肝炎病毒外膜大蛋白与HBV DNA的关系研究

目的:探讨乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)与HBV DNA的关系。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR法,检测320例乙型肝炎患者血清中的HBV-LP水平及HBV DNA载量。结果:HBV-LP水平与HBV DNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关(r=0.949);不同模式的HBeAg血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:血清HBV-LP水平能反映乙型肝炎患者体内HBV复制程度,是判断HBV复制的血清学指标。

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。结果对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P<001);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERTmRNA表达水平均显著低于对照组(P<001),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P<001)。结论EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。

葡萄胎和绒毛膜癌组织中葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

目的:探讨葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein,GRP94)在葡萄胎和绒毛膜癌组织中的表达及意义。方法:采用DA-KO EnVision免疫组织化学染色法对39例葡萄胎及20例绒毛膜癌组织中的GRP94进行染色,镜下观察GRP94在葡萄胎和绒毛膜癌组织中的特点,用图像分析软件对其积分光密度(IOD)进行分析。结果:39例葡萄胎组织中34例(87.2%)滋养层细胞胞质有GRP94表达,且合体滋养层细胞胞质比细胞滋养层细胞胞质表达强,P=0.000。在20例绒毛膜癌组织中16例(80%)癌细胞胞质有GRP94表达,同时也发现GRP94在合体滋养层细胞胞质比细胞滋养层细胞胞质表达强,P=0.017,且癌细胞胞质比癌旁平滑肌细胞胞质的表达强,P=0.000。在葡萄胎和绒毛膜癌滋养层细胞胞质中GRP94的表达随分化程度降低而升高,P=0.04;其中,在细胞滋养层细胞胞质中GRP94的表达也是随分化程度降低而升高,P=0.005。而在合体滋养层细胞胞质中发现GRP94的表达与分化程度不相关,P>0.05。结论:GRP94的表达强度与滋养细胞肿瘤的分化程度有关。

肾小球足细胞裂隙膜蛋白Podocin的变化与氧化应激反应

目的探讨氧化应激反应在肾小球足细胞裂隙膜分子屏障损伤中的作用。方法32只体重180～220g的♂SD大鼠按阿霉素给药剂量随机分成4组。于给药第3周末测尿蛋白的变化,同时处死大鼠取肾皮质检测氧化应激指标及肾小球Podocin蛋白的分布及半定量。结果①阿霉素组大鼠24h尿蛋白量及肾皮质丙二醛(MDA)量高于正常对照组,超氧化物歧化酶(SOD)量低于正常对照组,尤以中剂量组变化最明显。②正常对照组大鼠Podocin沿肾小球基底膜呈深褐色连续、线形分布;在中剂量组呈淡褐色点状或短线条状分布;量化分析显示,阿霉素组肾小球Podocin免疫组化分数明显低于正常对照组,尤以中剂量组最显著。③肾小球Podocin蛋白免疫组化分数与肾皮质MDA浓度呈负相关,与肾皮质SOD浓度呈正相关。结论蛋白尿的发生与肾小球足细胞裂隙膜蛋白Podocin的变化密切相关;肾小球足细胞裂隙膜蛋白Podocin的减少或缺失与以脂质过氧化反应为主的氧化应激反应密切相关。

日本血吸虫特异性膜蛋白的筛选及其中sj15蛋白编码序列的克隆

目的:筛选日本血吸虫可能的特异性膜蛋白,并根据筛选结果在日本血吸虫成虫中尝试克隆某一可能具有免疫保护功能的预测蛋白的编码序列,为血吸虫病防治研究寻找新的疫苗候选分子或药物靶标。方法:以"Schistosoma japonicum"和"membrane or tegument"为关键词,在公共数据库NCBI进行查找并下载数据,建立本地化的日本血吸虫膜蛋白序列数据库,与本实验室建立的曼氏血吸虫、人类、大鼠及小鼠蛋白质数据库等进行多序列比对,筛选日本血吸虫特异性膜蛋白,同时通过CBS网站相应分析工具软件预测目的蛋白的特征和功能。针对其中可能有免疫保护功能的预测蛋白的预测编码序列设计引物,采用RT-PCR技术从日本血吸虫成虫中扩增出该编码序列,并克隆入pGEX-4T-1构建原核表达重组质粒。结果:共检索到153个理论推测的日本血吸虫膜蛋白序列,筛选出28个可能的日本血吸虫特异性膜蛋白;成功从日本血吸虫成虫中扩增出相对分子质量为15 000的预测蛋白的预测编码序列,暂命名为sj15基因,同时成功构建pGEX-4T-1-sj15重组质粒。结论:成功筛选出多个日本血吸虫特异性膜蛋白;从日本血吸虫成虫中成功克隆出GenBank公布的预测的sj15基因,证实了成虫中该预测基因的存在,并成功构建原核表达载体,为进一步的功能研究奠定了基础。

霍奇金淋巴瘤潜伏膜蛋白1、p53及bcl-2蛋白的表达及意义

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)、p53、bcl-2的蛋白表达在霍奇金淋巴瘤(HL)致病机制中的作用及其意义。方法对收集的31例石蜡包埋的HL组织进行LMP1、p53、bcl-2蛋白免疫组化染色。结果LMP1、p53、bcl-2的阳性率分别为58.1%、61.3%、35.5%。LMP1与p53相关性分析具有统计学意义。结论p53可能参与LMP1在HL致病机制中的作用,bcl-2可能与HL的致病关系不大。

EB病毒潜伏膜蛋白和肿瘤的关系

EB病毒（EBV）是人类疱疹病毒，与淋巴系统、上皮细胞肿瘤相关。其编码潜伏性膜蛋白（LMP）包含LMP1、LMP2A和LMP2B。特别是LMP1，是众多EB病毒编码蛋白质中唯一被明确证明能恶性转化原代B细胞、鼠成纤维细胞和人上皮细胞的蛋白质。研究LMP与肿瘤的关系将为防治EB病毒相关肿瘤提供新的策略。

超极化停搏对心肌细胞膜蛋白生物物理特性的影响

目的观察超极化停搏对体外循环(CPB)中缺血再灌注心肌细胞膜蛋白生物物理特性变化的影响。方法建立猫CPB模型,随机分成3组:对照组(n=25)仅作单纯并行CPB;去极化停搏组(n=30)阻断主动脉(ACC)60min,恢复心脏血液再灌注60min,心脏停搏液使用高钾St.Thomas液;超极化停搏组(n=25)心脏停搏液使用含吡那地尔的低钾St.Thomas液,余处理与去极化停搏组相同。应用电子顺磁共振波谱测定心肌细胞膜蛋白巯基强/弱固定相峰高比值(hs/hw)和膜蛋白旋转相关时间(τc)的动态变化,同时直接测定心肌组织中氧自由基水平。结果对照组hs/hw和τc以及心肌组织中氧自由基水平在CPB前后无明显变化;去极化停搏组hs/hw和τc在ACC30min明显升高,并于再灌注期间进一步上升(P<0.01),同时伴有心肌中氧自由基水平的升高(P<0.05);超极化停搏组再灌注期间hs/hw和τc虽较对照组有所升高,但均明显低于去极化停搏组(P<0.05)。直线回归分析显示hs/hw和τc均与心肌组织中氧自由基含量呈显著正相关,相关系数分别为0.692和0.677(P<0.05)。结论超极化停搏能减少心肌再灌注期间氧自由基的产生,有利于CPB中缺血再灌注心肌细胞膜蛋白生物物理特性维持正常,减轻心肌的缺血再灌注损伤。

不同来源潜伏膜蛋白1基因转染对鼻咽癌CNE1细胞生长的影响

目的 :探讨不同来源的EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)基因转染对人高分化鼻咽癌 (NPC)细胞系CNE1生长的影响。方法 :采用脂质体介导法分别将含有来源于B95 - 8淋巴细胞标准株的LMP1基因 (B95 - 8-LMP1)和来源于NPC组织的LMP1基因 (CAO -LMP1)的质粒转染CNE1;RT -PCR和蛋白印迹法分别鉴定LMP1mRNA和蛋白表达 ;结晶紫法、流式细胞术和平板克隆形成法测定不同来源的LMP1对CNE1生长特性的影响。结果 :成功建立稳定表达不同来源LMP1的CNE1细胞系。两种不同来源的LMP1均可促进CNE1细胞的生长 (P <0 0 1) ;CAO -LMP1比B95 - 8-LMP1具有更强促进CNE1生长的作用 (P <0 0 1)。结论 :不同来源LMP1对CNE1的体外生长均有促进作用 ,CAO -LMP1比B95 -

膜型基质金属蛋白酶1在黏着斑激酶相关非激酶诱导肝星状细胞凋亡中的作用

目的应用黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)表达质粒瞬时转染纤维连接蛋白(FN)刺激的肝星状细胞(HSC),探讨膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)在FRNK诱导HSC凋亡中的作用。方法在体外,以FN刺激HSC增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSC,应用膜联蛋白/碘化丙啶双标记流式细胞术和透射电镜技术检测细胞的凋亡,蛋白免疫印迹及RT-PCR方法检测FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、MT1-MMP蛋白及其mRNA表达。结果FRNK表达质粒成功转染HSC,在翻译后水平抑制FAK磷酸化。与空质粒组比较,FRNK表达质粒转染HSC 48小时后,HSC凋亡率由(9.28±1.05)%增加至(25.37±1.92)%(P<0.01)。FRNK抑制FAK磷酸化后在翻译和转录水平上调MT1-MMP表达,2.26±0.14 vs 1.09±0.15(P<0.01);1.58±0.18 vs1.00±0.10(P<0.01)。结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒可诱导HSC发生凋亡,上调MT1-MMP可能是其机制之一。

原核表达肺炎链球菌毒力蛋白PspA对人类嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响

目的探讨原核表达肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)对人类嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响。方法将重组质粒pET-32a(+)/PspA转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导重组菌表达TRx-His-PspA融合蛋白并纯化;通过肠激酶切掉融合蛋白的TRx-His部分,获得PspA蛋白。用PspA蛋白免疫小鼠,获得抗PspA抗体。再将PspA蛋白加入到人类嗜中性粒细胞的培养基中共孵育,检测CXCL8释放水平的差异;最后,用抗PspA抗体检测其对PspA蛋白促人类嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响。结果中性粒细胞细胞内合成和释放到培养基上清液的CXCL8显著增加(P<0.05);而加入了抗PspA抗体后,PspA蛋白刺激人中性粒细胞释放CXCL8的能力明显减弱。结论 PspA可以上调人类嗜中性粒细胞趋化因子CXCL8的合成和释放,揭示了中性粒细胞和肺炎链球菌致病因素之间的关系。

老年高血压伴下肢动脉硬化症患者血小板微粒膜蛋白的变化

目的探讨老年原发性高血压(EH)伴下肢动脉硬化症(LEASD)患者血小板微粒膜蛋白的变化。方法选择老年EH伴LEASD患者组(32例),老年EH患者组(30例)、健康老年组(30例),用流式细胞术检测上述3组的血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的表达百分率。结果老年EH伴LEASD患者组血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的GPⅡb/Ⅲa表达的百分率明显高于老年EH患者组及健康老年组(P<0.01),而老年EH患者组明显高于健康老年组(P<0.01)。结论老年EH伴LEASD患者血小板微粒膜蛋白CD62p、活化的GPⅡb/Ⅲa指标显著升高,提示老年EH伴LEASD患者存在高凝状态,即血栓前状态。

流式细胞仪检测血小板表面膜蛋白

目的 :探讨对流式细胞仪检测血小板表面膜蛋白中可能出现的问题。方法 :试管中加入抗血小板表面膜蛋白相应抗体及富血小板血浆 (PlateletRichPlasma ,PRP)孵育洗涤后上机测定。结果 :血小板表面膜蛋白测定受样品采集、抗凝剂选择、试剂种类、正确设计及图像分析等因素的影响。结论 :为保证测定结果的准确性 ,应尽快按质控要求完善保证措施 ,建立本单位参考值 。

沙眼衣原体多态膜蛋白的研究进展

多态膜蛋白是衣原体科独有的一类外膜蛋白,与衣原体的致病机制和机体免疫应答等密切相关。对该蛋白的研究将有助于进一步了解衣原体的致病机制,寻找更好的诊断方法和防治措施。本文就目前沙眼衣原体多态膜蛋白的结构、功能和免疫学特性相关研究进展作一介绍。

华支睾吸虫硫氧还蛋白跨膜蛋白基因的生物信息学分析

目的：对华支睾吸虫硫氧还蛋白跨膜蛋白（CsTMX）基因进行生物信息学分析。方法利用生物信息学方法（InterProScan、SignalP、TMHMM和SWISS—MODEL等相关软件）对CsTMX基因及相应氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、信号肽、亲水性/疏水性、三级结构进行预测分析。结果 CsTMX基因的开放阅读框（ORF）包含414 bp，编码137个氨基酸，理论分子质量为16.04±103，等电点为5.16。TMHMM和SignalP3.0分析结果显示CsTMX含信号肽，其在第19～20位氨基酸之间有1个切割位点；InterProScan和SWISS—MODEL分析结果显示，TMX特征性结构域位于第21～27位氨基酸之间，并且具有高度保守的CPAC基因序列。结论利用生物信息学知识和各种分析软件对CsTMX所编码的cDNA序列及理论蛋白质的理化性质、结构和功能域等进行预测和分析，能够为开展CsTMX的表达及其功能研究提供理论依据。

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达 ,并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCVE2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达 ,采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白 ,能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白 ,其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。