利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1) cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5'接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体p PR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。

橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库构建及HbSRPP7互作蛋白筛选

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量。小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)的橡胶粒子蛋白组分,与橡胶粒子发育和橡胶生物合成密切相关。目前已知橡胶粒子上存在多种SRPP家族蛋白,但大部分成员的功能尚不清楚。SRPP可能通过与其他橡胶粒子蛋白相互作用发挥功能。为了筛选SRPP蛋白家族成员之一Hb SRPP7的互作蛋白,本研究利用位点特异性重组技术构建了原始库容为1.5×10^(7)CFU的均一化橡胶树胶乳膜蛋白酵母双杂交系统(membrane yeast two-hybrid system,MYTH)cDNA文库,该文库插入片段平均长度大于1500 bp,重组率约为100%。构建了用于MYTH系统筛选HbSRPP7互作蛋白的pBT3STE-SRPP7和pBT3SUC-SRPP7诱饵载体并确认其能在NMY32酵母菌株中正确表达,无自激活活性。使用pBT3STE-SRPP7诱饵质粒对胶乳MYTHcDNA文库进行筛选,获得21个HbSRPP7候选互作的蛋白,包括3个REF家族蛋白(HbREF1、HbREF3和HbREF8)、2个SRPP家族蛋白(HbSRPP1、HbSRPP2)、2个活性氧清除相关蛋白(thioredoxin H-type-like、L-ascorbate peroxidase 2)以及5个胁迫相关蛋白(high mobility group Bprotein 2-like、RPM1-interacting protein 4-like、stress-related protein-like、salt stress-induced hydrophobic peptide ESI3-like和F-box/kelch-repeat protein)。结果显示HbSRPP7除了可能通过与橡胶生物合成相关的橡胶粒子蛋白互作参与橡胶生物合成,也可能通过与生物和非生物逆境胁迫相关蛋白互作,响应橡胶树乳管生物和非生物逆境胁迫系统信号,参与橡胶粒子上的橡胶生物合成调控。该研究结果有助于了解SRPP家族蛋白的功能,为揭示橡胶粒子上参与橡胶生物合成的蛋白复合体组成,阐明橡胶生物合成及其调控的分子机制奠定基础。

大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建

前言大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是大豆上最普遍的病害之一，严重影响大豆的产量和品质，通过筛选与病毒互作的寄主蛋白，根据互作蛋白的功能和两者的作用机制可揭示病毒侵染的分子机制。对于病毒编码的膜蛋白或者膜相关特性的蛋白，由于具有膜结合特性，在生物体内的互作多发生在膜上。

水稻OsVDAC4诱饵蛋白载体的构建及鉴定

[目的]获得可用于筛选膜蛋白酵母双杂交文库的诱饵蛋白载体。[方法]在对Os VDAC4进行生物信息学分析的基础上,将Os VDAC4全长ORF分别与p BT3-N和p BT3-SUC连接,构建2个诱饵蛋白载体p BT3-Os VDAC4-N-Cub和p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub,利用膜蛋白酵母双杂交技术鉴定出可用于筛库的诱饵蛋白载体。[结果]p BT3-Os VDAC4-N-Cub和p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub都可以与目标蛋白互作,但由于Os VDAC4的N端有约50个可自由伸展的氨基酸残基导致p BT3-Os VDAC4-N-Cub本底反应非常强,Os VDAC4的C端存在于膜中而没有可自由伸展的氨基酸残基,p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub的本底反应很弱。[结论]p BT3-SUC-Os VDAC4-CCub可用于文库筛选,这为获取Os VDAC4的互作蛋白提供了基础。

BFAR与p75NTR的蛋白相互作用抑制p75NTR信号转导

p75NTR是低亲和力的神经生长因子受体,能与高亲和力受体TrkA协同作用促进细胞增殖,也能与细胞内配体结合介导死亡信号通路,诱导细胞凋亡.为了探讨p75NTR功能的调控机制,本文利用膜蛋白酵母双杂交技术从人胎脑cDNA文库中筛选到一个新的p75NTR相互作用蛋白--BFAR.通过对酵母的共转化、GST pull-down和免疫共沉淀实验,证实了p75NTR与BFAR蛋白在体内外相互作用的特异性.荧光共定位实验发现,两者可共定位于细胞质中.此外,荧光素酶检测实验表明,共转染p75NTR和BFAR能够抑制p75NTR介导的NFκB和JNK信号通路.细胞周期实验发现,BFAR在PC-12细胞和HEK293T细胞中的高表达使细胞周期中的G2/M期细胞数增加,S期细胞数量减少,而G0/G1期细胞数无显著差异.