2019新型冠状病毒潜在膜融合蛋白在雄性小鼠生殖系统的表达

目的研究生殖系统2019新型冠状病毒膜融合蛋白mRNA的表达情况。方法选取2020年5月从中山大学实验动物中心购买的6只12周龄C57小鼠作为研究对象。取正常雄性小鼠肾脏、睾丸、附睾头部、附睾体部、附睾尾部、输精管、精囊、前列腺及阴茎等组织,提取RNA,RT-PCR检测ACE2、CD147、TMPRSS2、ADAM17、IFITM3、LY6E、GPI的mRNA表达量。结果 ACE2在睾丸、附睾头部、精囊及阴茎有表达;CD147在生殖系统各部位均有较高表达;TMPRSS2在各部位的表达量均较少;ADAM17,IFITM3,LY6E,GPI在睾丸、附睾、输精管、精囊及前列腺均有不同程度的表达;ADAM17在睾丸、附睾头、精囊及阴茎表达量较高;IFITM3在睾丸、附睾头、附睾尾、精囊、前列腺及阴茎表达量较高;LY6E在附睾、输精管及前列腺表达量较高;GPI在各部表达均高,以睾丸、附睾尾及阴茎表达量为著。结论 2019新型冠状病毒膜融合蛋白mRNA在雄性小鼠生殖系统呈现不同水平表达,提示男性生殖系统亦存在受该病毒侵害的潜在危险。

HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答

构建编码HBV包膜 核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗 pHBs、pHBc ,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度 ,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗 ,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答 ,表明HBV包膜 核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效 .

猪繁殖与呼吸综合征病毒膜融合机制研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染疫病,对全球尤其是我国养猪业危害巨大。然而,目前对PRRS防控并未取得实质性成效,究其原因是PRRSV具有独特而且复杂的感染机制。作为一种具有囊膜的病毒,PRRSV感染宿主细胞必须经病毒囊膜与宿主靶细胞膜的融合(membrane fusion),这是由病毒膜融合蛋白(fusion protein)介导,宿主细胞受体、蛋白酶等诸多因素共同参与的复杂过程。干扰PRRSV膜融合将会有效阻止病毒的感染与传播。论文通过总结PRRSV膜融合机制最新研究进展,旨在为防控PRRS提供新的理论依据,同时为PRRSV新型药物开发、新型疫苗研制提供参考。

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的获得融合TAT短肽的融合蛋白GST-TAT-GFP,以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法以质粒pGEX-GFP为模板,扩增目的基因TAT-GFP,将其克隆至质粒pGEX-2T,用所构建的质粒pGEX-TAT-GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达,利用GS-4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54.3 kD的蛋白,其相对分子质量与GST-TAT-GFP融合蛋白相符;Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别;细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST-TAT-GFP融合蛋白。

我国自主开发出艾滋病病毒膜融合抑制剂

我国自主开发的艾滋病病毒膜融合抑制剂——西夫韦肽已顺利完成IIb期临床试验，其疗效十分显著。西夫韦肽属于国家一类创新专利药物．由天津扶素生物公司自主开发。扶素生物公司依据艾滋病病毒膜融合蛋白gp41的空间结构．全新设计和合成的新一代膜融合抑制剂，已经获得中国、美国及欧洲等专利授权．并已在国际杂志上发表10余篇相关专业文章。

我国自主开发出艾滋病病毒膜融合抑制剂

我国自主开发的艾滋病病毒膜融合抑制剂——西夫韦肽已顺利完成Ⅱb期临床试验，疗效十分显著。西夫韦肽属于国家一类创新专利药物，由天津扶素生物公司自主开发。扶素生物公司依据艾滋病病毒膜融合蛋白gp41的空间结构，全新设计和合成的新一代膜融合抑制剂，已经获得中国、美国及欧洲等专利授权，并已在国际杂志上发表了10余篇相关专业文章。

重组蛋白AdipoR1-EGFP真核表达质粒的构建和表达

目的构建重组pEGFP-N1-AdipoR1真核表达质粒并于HEK293T细胞中瞬时表达。方法提取HepG2细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以其为模板,PCR扩增AdipoR1基因,将其插入到pEGFP-N1质粒中,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-AdipoR1,通过脂质体法转染HEK293T细胞,采用酶标仪测定荧光强度,Western blot方法鉴定融合蛋白Adipo R1-EGFP的表达情况。结果 Western blot结果显示,融合蛋白AdipoR1-EGFP在分子量约70 kD处可见明显的目的条带;同时,与未转染质粒的空白对照组相比,转染pEGFP-N1和pEGFP-N1-AdipoR1的细胞中荧光强度都有明显升高,表明融合蛋白AdipoR1-EGFP在HEK293T细胞中成功表达,并且EGFP的荧光强度测定能很好地反映细胞中融合蛋白的表达水平。结论构建并表达AdipoR1-EGFP融合蛋白,所采用的EGFP融合蛋白表达方法简单高效,重复性好,为今后AdipoR1蛋白的表达及功能研究提供了重要参考。

利用I-Mutant2.0辅助设计与优化中东呼吸综合征冠状病毒融合抑制多肽

Ⅰ型膜融合蛋白(class I membrane fusion protein)在Ⅰ型包膜病毒入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。基于抑制六螺旋结构形成的多肽类融合抑制剂设计的原理是模拟该蛋白融合区域的自身序列,与病毒融合蛋白结合形成异源六聚体,从而阻断病毒与靶细胞膜的融合。此类融合抑制剂的传统设计主要基于一级与二级结构,但为进一步强化其抗病毒活性,通常需依赖病毒膜融合蛋白三级结构信息,从而限制了对那些尚无病毒蛋白三级结构信息的新发病毒的多肽类融合抑制剂的快速优化和研发。本研究提出了不依赖蛋白三级结构信息,而利用I-Mutant2.0软件来辅助设计和优化多肽类病毒膜融合抑制剂的设想。根据I-Mutant2.0的预测结果,以中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)为模型,分析该病毒HR2区融合抑制剂序列中若干适合与不适合优化的位点,并设计了一系列多肽。结果发现,对适合优化的位点进行调整的多肽,其对HR1的结合能力及对病毒的抑制活性均有所提升;反之,多肽活性明显下降。结果表明,利用I-Mutant2.0辅助设计与优化病毒融合抑制多肽的方法具有一定的可行性,为进一步开发新的融合抑制剂设计方法奠定了基础。

TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌发病中作用的研究进展

ERG基因可与雄激素调节跨膜丝氨酸蛋白酶基因融合,融合后形成的特异性雄激素调节跨膜丝氨酸蛋白酶-ERG(T2E)融合基因是前列腺癌组织中最常见的ERG融合基因类型。T2E融合基因能够通过促进ERG过表达,引起一系列相应的靶基因和信号通路改变,包括下调雄激素受体表达、上调组蛋白去乙酰化酶表达和抑制组蛋白乙酰转移酶表达、诱导果蝇Zeste基因增强子人类同源物2释放、抑制磷酸酶和张力蛋白同系物基因表达、激活Notch通路、影响前列腺素信号通路等,继而参与前列腺病的发生。

跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用

目的 制备跨膜型超抗原融合蛋白 ,研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。方法用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET 2 8a TM SEA转化E .coliBL2 1(DE3)pLysS宿主菌 ,在IPTG诱导下产生目的蛋白 ;用Ni NTAHisBindResin纯化带有His Tag的目的蛋白。采用免疫组化法、免疫荧光法和流式细胞术检测其对细胞膜的锚定作用。建立C5 7BL 6小鼠的黑色素瘤模型 ,观察跨膜型超抗原SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上。融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长 ,并延长其生存期。结论 跨膜型超抗原融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用 ,有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防。

慢病毒介导跨膜丝氨酸蛋白酶2∶ERG融合基因短发卡RNA靶向抑制前列腺癌细胞生长

目的 观察靶向抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）：ERG融合基因后对前列腺癌细胞生长的影响.方法 设计特异性作用于TMPRSS2∶ ERG融合基因的短发卡RNA （shRNA）,并进行慢病毒包装后感染前列腺癌细胞,进一步通过噻唑蓝（MTT）实验,以及流式细胞术研究ERG基因沉默后前列腺癌细胞增殖的变化.结果 成功构建并筛选到高效特异性的shRNA1序列,在mRNA水平的靶向抑制效率为79％,蛋白水平的靶向抑制率为93％;靶向抑制TMPRSS2∶ ERG融合基因表达96 h后,前列腺细胞生长速度降低了33.34％;细胞周期分析发现ERG基因沉默后的VCaP细胞S期和G2/M期细胞比例分别由10.0％降至6.6％,29.1％下降到17.25％,而G0/G1期细胞比例由51.7％升高到71.2％.结论 靶向抑制TMPRSS2∶ ERG融合基因的表达可以显著抑制前列腺癌细胞的生长.

病毒融合基因包膜糖蛋白通过抑制NF-κB活性诱导HL-60细胞死亡

目的探讨猿猴白血病病毒融合基因包膜糖蛋白(GALV-FMG)诱导白血病HL-60细胞的死亡效应与NF-κB的关系。方法将HL-60细胞分为pcDNA3.1(+)-GALV-FMG质粒转染(A)组、pcDNA3.1(+)空载体对照(B)组和空白对照(C)组。脂质体转染后,应用乳酸脱氢酶释放实验检测GALV-FMG引起HL-60细胞的死亡效应,免疫荧光和凝胶电迁移检验分析GALV-FMG在诱导HL-60细胞死亡中NF-κB的活性。结果与B、C组相比,A组细胞中NF-κB的活性受到了明显的抑制,细胞死亡的发生显著增加(P<0.05)。结论 GALV-FMG的表达可诱导HL-60细胞发生死亡;其机制可能与NF-κB的活性抑制有关。

腺病毒介导线粒体融合蛋白2基因转染对糖尿病大鼠七氟醚后处理心肌保护作用的影响

目的 探讨腺病毒介导线粒体融合蛋白2（Adv-Mfn2）基因转染对糖尿病大鼠七氟醚后处理心肌保护作用的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠,体重210～260 g,3～4月龄,腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg制备糖尿病模型.取糖尿病模型制备成功的大鼠50只,采用随机数字表法分为5组（n=10）：假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、七氟醚后处理组（SP组）、Adv-Mfn2＋缺血再灌注组（M＋I/R组）和Adv-Mfn2＋七氟醚后处理组（M＋SP组）.采用结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注120 min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.SP组和M＋SP组于再灌注前1 min时吸入七氟醚,呼气末浓度2.5％,持续5 min;M＋I/R组和M＋SP组于腹腔注射链脲佐菌素后1 min,经舌下静脉注射Adv-Mfn2 2＆#215; 1010pfu/kg.于再灌注120 min时取腹主动脉血样,测定血清CK-MB活性和cTnI浓度;随后处死大鼠,取心肌组织,采用TUNEL法检测细胞凋亡情况,计算凋亡指数（AI）;取心尖组织,采用Western blot法检测Mfn2的表达,观察心肌病理学结果并进行病理学损伤评分.结果 与S组比较,I/R组、SP组、M＋I/R组和M＋SP组血清CK-MB活性、cTnI浓度、AI和心肌损伤评分升高,Mfn2表达下调（P＜0.05）;与I/R组比较,M＋I/R组和M＋SP组血清CK-MB活性、cTnI浓度、AI和心肌损伤评分降低,Mfn2表达上调（P＜0.05）,SP组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）;与SP组比较,M＋I/R组和M＋SP组血清CK-MB活性、cTnI浓度、AI和心肌损伤评分降低,Mfn2表达上调（P＜0.05）.与M＋I/R组比较,M＋SP组血清CK-MB活性、cTnI浓度、AI和心肌损伤评分降低,Mfn2表达上调（P＜0.05）.结论 Adv-Mfn2基因转染可改良七氟醚后处理对糖尿病大鼠的心肌保护作用.

hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析

目的构建包含有核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1,并对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA,以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因,利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1,在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒,然后将重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况,Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况,最后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA(应激颗粒的标记成分)及DPC1a(加工体的标记蛋白)的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达;EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位,但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNPA1质粒成功构建并表达,应激状态下EGFP标记的hnRNPA1参与应激颗粒的构成。

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白, 组 I类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64, 而组 II类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F。本文以组II类型的HaSNPV为研究对象, 研究组I类病毒的GP64能否在组 II类病毒中正确表达和包装。利用 Bac to Bac系统, 构建了带有 AcMNPV膜融合蛋白 GP64 和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+ egfp+, 同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒 HaSNPVegfp+, 通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测, 证明GP64可在HzAM1中表达, 并被包装入子代BV。

ureI和ctB-ureI真核质粒构建及表达分析

目的：构建ureI和ctB—ureI真核表达质粒并分析其在细胞的表达情况。方法：用pIRES-RD2真核表达载体分别在5’端连接ureI和ctB—ureI基因，经双酶切和测序鉴定正确后，相应质粒用脂质体转染HEK293T细胞，用荧光显微镜观察荧光标签，确定质粒的转染率；用人抗幽门螺旋杆菌抗体和马抗CtB抗体，采用免疫荧光和免疫酶组织化学等方法研究该两种真核表达质粒在细胞中目的蛋白表达情况。结果：成功构建了ureI和ctB—ureI的真核表达质粒pIRES—RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB—ureI，用此质粒转染HEK293T细胞48～72h后，荧光显微镜显示该两种质粒的转染率约为80％；用免疫荧光和免疫酶组织化学方法表明了该两种基因均能在HEK293T细胞表达并有免疫反应性，表达的ureI主要分布在胞质内或细胞膜附近，ctB—ureI在CtB信号肽引导下分布于HEK293T细胞质、细胞膜附近以及细胞外。结论：成功构建了真核载体pIRES2-DsRed2-ureI和pIRES2-DsRed2-ctB—ureI，目的蛋白表达于HEK293T细胞胞质内并有一定免疫反应性。

dsDNA噬菌体裂解系统作用机制的研究进展

噬菌体作抗生素替代物用于动物生产,已被逐步认可和积极评价。将噬菌体应用于抗菌,主要是应用其裂解作用。为更科学地研发和应用噬菌体,本文综述了应用较普遍的dsDNA噬菌体近年来相关裂解机制的研究。目前发现,绝大多数dsDNA噬菌体均采用"穿孔素-内溶素"裂解系统,其主要由穿孔素和内溶素组成,分别破坏细菌细胞膜和肽聚糖层,致使细菌被裂解;而对革兰阴性菌的裂解,还需膜融合蛋白的参与。此外,还存在一种"针穿孔素-SAR内溶素"裂解系统,其主要由针穿孔素、信号锚定释放内溶素和膜融合蛋白组成,作用机制与上述裂解系统存在明显差异。本文为开发和应用噬菌体及其裂解相关蛋白提供了理论基础。

PKCα／HO-1信号通路在内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤中的作用：与Mfn1的关系

目的评价蛋白激酶Cα（PKCα）／血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路在内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤中的作用及其与线粒体融合蛋白-1（Mfnl）的关系。方法将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞以1×104个／ml密度接种于96孔板中。采用随机数字表法分为5组（n=15）：对照组（C组）、内毒素攻击模型组（E组）、PKCα抑制剂G06976组（G组）、PKCα激动剂PMA组（P组）和二甲基亚砜组（D组）。采用给予10μg／mlLPS刺激NR8383细胞的方法制备肺泡巨噬细胞内毒素攻击模型。G组、P组和D组于LPS刺激前30min分别给予5txmol／LG06976、100nmol／LPMA、0．1％二甲基亚砜预处理30min，再给予10μg／mlLPS，各组均孵育24h后收集细胞，检测丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用Westernblot法及q-PCR法检测PKCα、HO-1和Mfnl的表达。结果与C组比较，E组、G组、P组和D组MDA和ROS含量升高，SOD活性降低，PKCα、HO-1及其mRNA表达上调，Mfnl及其mRNA表达下调（P〈0．05）；与E组比较，G组MDA和ROS含量升高，SOD活性降低，PKCα、HO-1、Mfnl及其mRNA表达下调，P组MDA和ROS含量降低，SOD活性升高，PKCα、HO-1、Mfnl及其mRNA表达上调（P〈0．05），D组上述指标差异无统计学意义（P〉O．05）。结论PKCαHO-1信号通路激活后促进Mfnl表达是内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤时的内源性保护机制。

SIRT1介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制与Mfn2的关系

目的评价沉默调节蛋白1（SIRT1）介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制与线粒体融合蛋白2（Mfn2）的关系。方法SPF级健康成年雄性SD大鼠24只，体重210～220 g，采用随机数字表法分为3组（n＝8）：对照组（C组）、糖尿病组（DM组）、糖尿病＋SIRT1激动剂SRT1720组（DM＋SRT组）。采用腹腔注射1%链脲佐菌素60 mg/kg的方法建立大鼠糖尿病模型。DM＋SRT组连续7 d尾静脉注射SIRT1激动剂SRT1720 1 mg/kg。随后采用超声法测定心功能指标：左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室射血分数（LVEF）、心率（HR）、舒张早期心室充盈速度最大值（E）、舒张晚期心室充盈速度最大值（A）和峰值流速比值（E/A比值）；取心肌组织，采用免疫共沉淀法检测SIRT1与Mfn2的结合水平、Mfn2乙酰化水平；Western blot法检测SIRT1、Mfn2、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、LC3Ⅰ、Beclin1和P62的表达，计算LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）。结果与C组比较，DM组LVEDV、LVEF、HR、E和E/A比值降低，A升高，LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，Beclin1、SIRT1和Mfn2表达下调，P62表达上调，Mfn2-SIRT1结合水平降低（P〈0.05）。与DM组比较，DM＋SRT组LVEDV、LVEF、E和E/A比值升高，A降低，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，Beclin1和SIRT1表达上调，P62表达下调，Mfn2-SIRT1结合水平升高，Mfn2乙酰化水平降低（P〈0.05）。结论SIRT1介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制与其对Mfn2的去乙酰化作用有关。