NF-kB、HB-EGF在人输卵管壶腹部黏膜表达

目的:探讨核因子kB(NF-kB)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)在人体正常、炎症、妊娠输卵管壶腹部黏膜表达及作用。方法:利用免疫组化法和图像分析技术检测NF-kB、HB-EGF在人输卵管黏膜的表达。结果:人体正常、炎症、妊娠输卵管壶腹部黏膜上皮细胞均有NF-kB和HB-EGF表达,炎症组和妊娠组NF-kB的表达与正常组比较均显著增强,差异有极显著性(P<0·01);HB-EGF的表达炎症组较正常组增强,差异有显著性((P<0·05),妊娠组较正常组显著增强,差异有极显著性(P<0·01)。结论NF-kB、HB-EGF表达于输卵管壶腹部黏膜,参与输卵管生理、病理过程。

人骨唾液蛋白和基质金属蛋白酶-9在风湿性心脏病瓣膜表达的研究

人骨唾液蛋白（hBSP）是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白,主要分布在矿化的组织中,由成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞表达和分泌。近年来对于其在肿瘤骨转移性钙化方面引起了人们的普遍关注。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种锌离子依赖性明胶酶,可降解细胞外基质成分,

膜表达热休克蛋白70真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞的转染

目的构建普遍适合性的膜表达热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,修饰并建立HSP70表达并结合在细胞膜表面的肿瘤细胞。方法RT-PCR法从人胚肾中获取HSP70的cDNA,扩增成带酶切位点的目的基因。选择载体pDisplay,将目的基因插入载体多克隆酶位点中。DNA测序证实后,以脂质体转染的方法,将载体转染到黑色素瘤细胞。用G418抗性筛选获得阳性克隆。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;目的基因的上游带信号肽序列,下游带跨膜序列。RT-PCR产物电泳、WesternBlotting、激光共聚焦显微镜和流式细胞术证实大量HSP70表达并结合在转染的黑色素瘤细胞膜表面。结论成功地构建了膜表达HSP70的真核表达载体;转染到黑色素瘤细胞后,细胞膜表面表达丰富的HSP70。转染细胞可以进一步制备新型瘤苗。

白介素-6参与大鼠骨癌痛的外周敏化机制:白介素-6通过JAK-PI3K通路上调伤害性感觉神经元中TRPV1膜表达

原发性或转移性骨癌痛严重影响患者的身心健康。目前对骨癌痛的发生机制并不明确，临床也缺乏有效地治疗措施。本研究从细胞因子白介素-6（IL-6）上调辣椒素受体（TRPV1）的角度，探讨骨癌痛的外周发病机制。方法：（1）骨癌痛模型：采用大鼠胫骨注射MRMT-1乳腺癌细胞，建立胫骨骨癌痛模型。

膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗抗肿瘤治疗作用研究

目的研制膜表达热休克蛋白(HSP)70瘤苗并研究其抗肿瘤治疗作用。方法以膜表达HSP70的真核表达载体pDisplay-mbHSP70转染肠癌细胞株CT26。用G418抗性筛选获得阳性克隆,扩增并制备瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应;在BALB/c小鼠结直肠癌模型中观察瘤苗的抗肿瘤治疗作用;并检测实验鼠的自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明,大量HSP70表达并结合在肠癌瘤苗细胞膜表面。比较对照,胞浆表达HSP70瘤苗显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应,较强的瘤体生长抑制,并使荷瘤鼠的生存时间延长;而膜表达HSP70瘤苗比胞浆表达者有着更高的淋巴增殖刺激效应,更强的瘤体生长抑制作用,并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长。结论HSP70表达并结合在细胞膜表面的肠癌细胞瘤苗对结直肠癌CT26荷瘤小鼠有更强的治疗作用。

重组GPI-B7胞外段在中华仓鼠卵巢癌细胞膜上的表达

目的 通过从衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列克隆到PCI-dhfr真核表达载体,利用GPI信号序列对B7-1基因胞外段序列进行修饰,实现GPI-B7-1锚定蛋白在中华仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)膜表面的表达。方法 应用RT-PCR方法从B淋巴细胞瘤细胞系(Raji细胞系)总RNA中钓取B7-1(CD80)全长基因,扩增B7-1胞外段分子并克隆到已含有GPI修饰性信号序列的真核表达载体pCI-dhfr上,应用脂质体方法转染到CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用细胞免疫荧光进行鉴定。结果 成功地克隆了B7-1全长基因,并扩增了胞外段基因构建到含有GPI修饰性信号序列的真核表达载体pCI-dhfr上,实现了GPI-B7-1锚定蛋白在CHO细胞膜的表达。结论GPI信号序列能够通过其脂质性尾部将GPI-B7-1锚定蛋白整合到细胞膜表面,本研究结果为将来应用GPI-B7-1分子于肿瘤细胞膜表面的修饰做了技术准备,可作为肿瘤免疫治疗的手段。

腹膜透析对碱性成纤维生长因子在大鼠腹膜表达的影响

腹膜超滤衰竭（UFF）是长期腹膜透析（PD）的主要并发症．而UFF患者腹膜组织病理柃查显示新生血管明显增多。碱性成纤维生长因子（bFGF）是目前公认的促血管生成因子，在腹膜间皮细胞呈结构性表达，在CAPD患者腹透液中也可榆测到bFGF。因此，本研究探讨bFGF在腹膜组织新生血管形成中可能的作用及机制。

McAb共刺激PBLs膜表面分子表达与肝癌细胞凋亡的相关性

目的 :研究McAb共刺激PBLs前后的表型变化及与肝癌细胞凋亡的相关性。方法 :采用流式细胞仪分析PBLs被刺激前后的表型 ,用电镜超微结构和DNA梯子电泳观察肝癌细胞凋亡。结果 :CD3、CD4分子表达高于刺激前约 10 % ,肝癌细胞出现凋亡 ,细胞核固缩、边聚、裂解。同时也出现典型的DNA梯子。而肝癌患者用共刺激PBLs后 ,CD3和CD8增高 (P <0 0 5 )。结论 :共刺激使共刺激信号分子增加 ,抗原呈递能力增强 ,也使细胞因子分泌增加 ,这些因素促使肝癌细胞凋亡 ,而肿瘤患者T细胞增加时向CD8+ 分化 ,结果提示膜分子的表达与凋亡密切相关。

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol.L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被量为3.74μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50。用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%。

N-甲基-D-门冬氨酸受体与使君子酸受体在培养海马神经元树突上的膜表面表达与共定位

目的 研究含NR2B亚单位的N 甲基 D 门冬氨酸 (NMDA)受体 (NR2B NMDAR)与含GluR1亚单位的使君子酸 (AMPA)受体 (GluR1 AMPAR)在发育不同阶段的培养海马神经元树突上的膜表面表达与共定位。 方法 以FLAG NR2B和GFP GluR1表达载体共转染原代培养第 5d(DIV5 )的大鼠海马神经元 ,分别用相应特异性抗体和荧光标记二抗作活细胞染色 ,显示膜表面表达的受体簇。 结果 对DIV7和DIV14的培养海马神经元树突表面受体簇计数 (个数 10 0 μm) ,GluR1 AMPAR受体簇分别为 5 9 2± 5 6和 74 8± 3 1(P <0 0 5 ) ;NR2B NMDAR为 38 7±3 5和 80 8± 4 9(P <0 0 1) ;两者共定位为 16 3± 5 2和 4 0 1± 6 0 (P <0 0 1)。DIV14海马神经元 4 0 %的共定位受体簇分布在树突棘上。 结论 随着海马神经元的发育 ,树突膜表面NR2B NMDAR、GluR1 AMPAR及两者共定位受体簇密度均增加 ,提示 ,形成更多具有活性的兴奋性突触 ,且主要位于树突棘上。

鸡Igλ轻链基因克隆、序列分析及其在COS7细胞膜上的定位表达

为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。

膜结合表达对HCV C基因免疫的影响

目的探讨膜结合表达对基因免疫的影响。方法流感病毒跨膜蛋白基因修饰带 HBV pre C分泌型信号肽的HCV C6 9基因 ,构建 pc6 9TM质粒 ;35S-甲硫氨酸代谢标记和免疫沉淀检测质粒体外瞬时表达蛋白 ;肌肉免疫 Balb/c小鼠。结果 pc6 9TM基因表达出的蛋白存在于膜上。免疫鼠淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力 pc6 9TM较分泌表达型质粒pc6 9显著增强 (P=0 .0 3) ,而 2种质粒诱导小鼠产生抗体效价差异不显著 (P=0 .76 5 )。结论膜结合表达能增强 HCV C6

糖皮质激素受体对肾小球系膜细胞表达细胞间黏附分子1的影响

目的:探讨糖皮质激素(GC)对TNF-α诱导后MC表达细胞间黏附分子(ICAM-1)增加的抑制作用,以及糖皮质激素受体(GR)阻断剂对其的影响。方珐:雄性SD大鼠25只,分离并培养肾小球系膜细胞。对照组,MC用生理盐水处理24 h;TNF-α组,MC用TNF-α(终浓度为100 U/ml)处理24 h;TNF-α+Dex组,MC用TNF-α(终浓度同上)和Dex(终浓度为10-8mol/L)

昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性

利用Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验,均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REVenv。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后,可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体,并可抵抗REV病毒感染。

ABCG2在大肠癌中的表达及其对预后的影响

背景 ABCG2是ATPbinding cassette转运蛋白家族中的成员,与多药耐药和SP(side population)表型相关。研究表明,ABCG2在多种肿瘤的生物学行为方面起着重要的作用。目的探讨ABCG2在大肠癌的表达方式与临床病理学变量以及患者生存率的关系,为进一步的功能鉴定奠定基础。方法 225例大肠癌组织免疫组化染色(SP法),分别进行细胞膜和细胞浆染色的半定量分析。通过统计学方法分别分析其与临床病理学资料的相关性,并对随访的69例大肠癌患者进行生存分析。结果在225例大肠癌组织中,83.1%的组织在细胞浆有ABCG2的表达,而66.2%的组织在细胞膜有ABCG2的表达;15.6%的组织在细胞膜上呈现ABCG2的强表达。ABCG2在细胞浆上的表达,与大肠癌高的肿瘤分期(Dukes)(P=0.039)相关;ABCG2在细胞膜上的表达,与大肠癌高的肿瘤分期(Dukes)(P<0.01)、淋巴结(P<0.01)和远处转移(P<0.01)相关。随访的69例大肠癌患者的生存分析表明,ABCG2在细胞膜的强表达与生存率的降低相关(Cox回归:P=0.038)。结论 ABCG2在大肠癌中的表达是普遍升高的,其在大肠癌的转移过程中可能起作用,是一种新的预测大肠癌预后的分子标记。

锚定表达GM-CSF疫苗的抑瘤效果研究

目的:研究锚定表达GM—CSF的小鼠黑色素瘤作为肿瘤疫苗的有效性。方法:GM-CSF基因嵌合GPI信号肽修饰序列实现在B16小鼠黑色素瘤细胞表面的锚定表达,研究锚定修饰的B16细胞于同源C57BL/6小鼠的成瘤性及诱导抗肿瘤免疫的效果。结果:抑瘤实验结果表明,锚定修饰GM—CSF的肿瘤细胞免疫原性增强,成瘤性明显下降;成瘤率为58.8％,而肿瘤对照组为100％。活瘤苗接种实验结果显示锚定修饰的肿瘤细胞可以预防肿瘤的发生,肿瘤发生率仅为20％,说明抗肿瘤的免疫应答有记忆性,能够有效地防止野生型肿瘤细胞的攻击。结论:锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞可以诱导抗特异性的抗肿瘤反应,这种设计可以应用于肿瘤疫苗的研究中。

聚苯丙赖氨酸真核表达质粒的构建及其表达

目的制备膜表达聚苯丙赖氨酸蛋白瘤苗并研究其抗肿瘤治疗作用。方法人工合成表达聚苯丙赖氨酸的DNA片断，扩增成带酶切位点的目的基因。选择载体pDisplay，将目的基因插入载体多克隆酶位点BgⅠ Ⅱ、PstⅠ之间。DNA测序证实后．以脂质体转染的方法转染到鼠CT26细胞。采用G418抗性筛选并扩增阳性克隆，化疗药处理后采用化学偶连两步法使跨膜型多聚苯丙赖氨酸与肠癌细胞膜共价偶连，构建成新型瘤苗，观察瘤苗体外免疫效应。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确，目的基因的上游带信号肽序列，下游带跨膜序列。RT—PCR产物电泳、流式细胞术、激光共聚焦显微镜证实聚苯丙赖氨酸表达在转染的鼠CT26细胞膜上，体外免疫学实验显示瘤苗细胞体外对淋巴细胞增殖刺激效应显示有较强的淋巴增殖效应，产生的多克隆抗体对CT26肠癌细胞有特异性杀伤作用。结论聚苯丙赖氨酸跨膜修饰的瘤苗能够产生特异、较强的免疫效应。

C末端缺失NR2B亚单位表达载体的构建及其在NMDA受体装配研究中的应用

目的 :研究 NMDA受体 NR2 B亚单位细胞内 C末端 ,在 NR1- 1a/ NR2 B亚型 NMDA受体装配和表面表达中的作用。方法 :构建 C末端不同缺失和 GFP标记的 NR2 B亚单位表达载体 ,单独转染或与 NR1亚单位共转染到 HEK2 93细胞 ,用抗 GFP多克隆抗体和 Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色。结果 :成功构建了 8个 C末端不同缺失的 GFP- NR2 B表达质粒 (GFP- NR2 BΔ1～Δ 8)。将 GFP- NR1- 1a,GFP- NR2 B及 GFP- NR2 BΔ 1～Δ 8分别单独转染 HEK2 93细胞 ,不能获得达细胞膜表面的表达。而将这些质粒分别与 NR1- 1a共转染 2 93细胞 ,发现 GFP - NR2 B及 C末端部分缺失的 GFP- NR2 BΔ1～Δ6 ,均能与 NR1- 1a一起表达于细胞膜表面 ,而仅留有 PDZ结合基序的 GFP- NR2 BΔ7和 C末端全长缺失的 GFP- NR2 BΔ8,则不能与 NR1- 1a一起表达于细胞膜表面。结论 :NR1- 1a与 NR2 B的共表达和装配 ,是形成 NR1- 1a/ NR2 B亚型 NMDA受体并表达于细胞表面的必要条件。NR2 B与 NR1- 1a装配时 ,NR2 B对 NR1- 1a C1盒中内质网滞留基序的遮蔽和阻滞作用 ,并不依赖于 NR2 B C末端某一特定的区域 ,相反可能仅要求有一定长度的 NR2 B C末端。

EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

目的构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆人慢病毒pLVX-EF1.-RES-ZsGreen1表达载体,使用Lent-X Packagng Singie Shots(VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1l-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10^-10 molL),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTCO537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-SeFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。