基于膜上的酵母双杂交系统及其在药物开发中的应用

蛋白质是生命活动的基础.生物体内的蛋白质之间都存在着复杂的相互关系.由于蛋白质中的膜蛋白在各种各样重要细胞过程中起着关键的作用,如光合作用、呼吸作用、信号传导、免疫反应和营养物质的吸收等,因此越来越受到研究者们的重视.对膜蛋白的研究也越来越多.但因为膜蛋白具有疏水性,所以常常用传统的生物化学和遗传学方法,难以对膜蛋白之间以及膜蛋白与胞质蛋白之间的关系进行分析和鉴定.而传统的酵母双杂交系统又因其局限性,不能广泛地用于研究膜蛋白的相互作用.对研究膜蛋白之间及膜蛋白与胞质蛋白之间关系的一种有效方法—基于膜上的酵母双杂交系统,以及该方法在药物开发设计领域中的运用进行了介绍和综述.

利用酵母双杂交系统研究桑脉带相关病毒核外壳蛋白自身相互作用

桑脉带相关病毒(mulberry vein banding-associated virus,Mu VBa V)属布尼安病毒科番茄斑萎病毒属,是广西桑树病毒病的主要病原。为研究其核外壳蛋白(nucleocapsid protein,N)的自身相互作用,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统构建了N蛋白的诱饵表达质粒和猎物表达质粒并转化酵母菌株NMY51。诱饵表达质粒p BT3-SUC-Mu VBa V-N或p DHB1-Mu VBa V-N和阳性对照质粒p Ost1-Nub I共转化的酵母菌在筛选性营养缺陷型培养基上SD-trp-leu-his-ade(SD-AHLW)均能正常生长,而与阴性对照质粒p PR3-N共转化的酵母在营养缺陷型SD-AHLW平板上不能正常生长,表明N蛋白诱饵质粒的表达产物没有自我激活活性,对酵母细胞也没有毒性。N蛋白诱饵表达质粒及其猎物表达质粒共转化的酵母也可以在SD-AHLW培养基上正常生长,说明N蛋白在酵母细胞中可发生自我相互作用。本研究结果为今后研究Mu VBa V N蛋白的功能以及通过筛选桑c DNA文库获得互作寄主因子奠定了良好的基础。

水稻水通道蛋白OsPIP1;3与白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1互作关系研究

本文通过片段缺失和定点突变的方法构建产生水稻（Oryza sativa）水通道蛋白OsPIP1;3的变异本。通过膜酵母双杂交进行蛋白互作分析,实验结果表明水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）harpin蛋白Hpa1能与OsPIP1;3互作,但如果将OsPIP1;3的一个胞外序列（loopE）及OsPIP1;3的第六个跨膜区域（TM6）删除,则互作不能发生。进一步对276-279 aa进行替换,OsPIP1;3与Hpa1不再发生互作。这些结果说明,OsPIP1;3序列上的loop E和TM6上的氨基酸对OsPIP1;3–Hpa1互作有重要影响,而276-279 aa是可能的互作位点。

番茄斑萎病毒GN与西花蓟马互作蛋白的初步筛选

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)的主要传播媒介,以循环增殖方式传播TSWV,但在传播过程中参与的互作蛋白尚不清楚。本研究以TSWV的外鞘糖蛋白GN(Glycoprotein N)为诱饵筛选与西花蓟马互作的蛋白,为阐明TSWV与西花蓟马的互作机制提供依据。【方法】构建以pPR3-N为载体的西花蓟马泛素分裂酵母双杂交膜系统cDNA文库,利用Gene Ontology(GO)通路注释互作蛋白,分析其生物学功能。【结果】西花蓟马cDNA文库库容为3.2×10^6,除去重复序列、载体序列和移码序列,筛选到74个与GN互作的蛋白,参与了细胞过程、代谢过程、生物调节过程等12种生物过程。【结论】成功构建了西花蓟马酵母双杂交膜体系cDNA文库,筛选到与TSWV GN互作的蛋白,为进一步研究TSWV与西花蓟马的互作机制奠定了基础。