自主复制序列结合因子1结合位点拷贝数对基因沉默的影响

目的研究自主复制序列结合因子1(Autonomously replicating sequence-Binding Factor,Abf1)的拷贝数对基因沉默的影响。方法用右侧带有报告基因URA3的不同拷贝数的abf1p结合位点,以及不带任何结合位点的序列替代酵母基因组HML区域的HML-I沉默子后,在HML-E存在和不存在这两种情况下,比较URA3基因表达量的差异。结果在HML-E沉默子存在的条件下,在缺失尿嘧啶合成缺陷型培养板(-ura)上,所有的菌体生长状态相差不多,但是在5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid,FOA)平板上,随拷贝数的增加,菌株生长状态越好。但是在HML-E不存在的条件下,无论是-ura还是FOA平板上酵母都无法存活。结论 Abf1p结合位点独自无法对插入的外源基因进行沉默,它形成基因沉默需要沉默子的帮助,并且随着拷贝数增加基因沉默的能力增强。

水稻DNA的自主复制序列的分离及鉴定

以酵母整合型质粒YIP5为载体,用“鸟枪法”从水稻IR26的总DNA中分离到7个能在啤洒酵母细胞中进行自主复制的DNA片段(Autonomously Replicating Sequence,简称ARS).这些重组质粒都能以高频率转化Ura^-的酵母品系8534-8c.除一例外,带有这些质粒的酵母细胞都不稳定,并生长缓慢,表现出典型的ARS质粒性.将最小的单一插入片段——ARS8从胶上回收,纯化后用^(32)p标记作为探针,与水稻总DNA的酶切片段进行杂交得到单一的杂交带,证明了本实验分离到的ARS8的来源.

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene,PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences,ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene,LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。

水稻核DNA来源的带有自主复制功能的高度重复序列的分离及鉴定

以酵母整合型质粒YIP5-Km为载体,从HindⅢ消化的水稻(珍山97不育系)DNA中分离到一些在酵母细胞中能自主复制的DNA片段(Autonomously Replication Sequence,简称ARS).其中ARS2为4.0 kb,ARS7为14.2 kb. 用Southern杂交证明它们来源于水稻的核DNA,而且它们在水稻核DNA中是高度重复序列.文中还对ARS2和ARS7进行了亚克隆分析,结果表明ARS2的三个亚克隆片段ARS2-1,ARS2-2,ARS2-3都是高度重复序列,而且ARS2-2,ARS2-3还具有ARS功能;ARS7的三个亚克隆片段中只有ARS7-1是高度重复序列但无ARS功能,ARS7-3有ARS功能但不是高度重复序列.

自主序列复制方法检测HCV感染的临床应用

目的：ＰＣＲ是在体外模拟自然ＤＮＡ复制过程的核酸扩增技术，３ＳＲ系统是模仿逆转录病毒ＲＮＡ基因组的复制机理，通过ｃＮＤＡ中介体使ＲＮＡ复制，此反应是由逆转录酶ＲＮａｓｅＨ和ＲＮＡ联合酶协同完成。无需高温变性及特殊装置。应用此原理对ＨＣＶ感染进行检测。方法：本实验引物Ａ１位于５′端，长５２个碱基，包括Ａ１５′端的Ｔ７聚合酶结合位点，Ａ２、Ａ３位于３′端，分别为２３个碱基和２４个碱基，Ａ１。

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。

具有自主复制功能的水稻高度重复序列ARS2的结构和功能分析

对一个水稻珍汕97A不育系核DNA来源的具有自主复制功能的高度重复顺序片段ARS2（全长4270bp）进行了亚克隆构建和测序，获得了它的全顺序．该片段富含AT（69％），有2个ARS核心顺序（A／TTTTAPuTTTA／T），7个类核心顺序，其上下游20～50bp内有TNTPuAA的ARS特征顺序；并分析得出它的2个ARS功能关键区域（分别长400bp和360bp）．同时，还首次发现了具有较高多态性的水稻微卫星DNA（AT）n．

自主序列复制

自主序列复制汪晓辉杨瑞馥作者单位：１０００７１北京，军事医学科学院微生物流行病研究所自主序列复制（ｓｅｌｆ－ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｌｉｃａ－ｔｉｏｎ，３ＳＲ）是随着聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ－ａｃｔｉｏｎ，ＰＣ...

啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近核小体的定位

以微球菌核酸酶法分离的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色体单核小体DNA为模板进行PCR,根据不同靶序列PCR产物拷贝数的不同定位核小体位置。结果表明,啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近核小体位置大约在39107位到39269位、39318位到39470位及39540位到39694位之间,理论计算结果与试验结果基本一致。

Isolation and Chromosomal Mapping of a Corn B Chromosome Specific RAPDs

B染色体存在于多种动植物中 ,具有很多独特的性状。B染色体与正常染色体在DNA组成方面十分相似 ,寻找B染色体特异序列一直是B染色体研究的难点和热点。通过对含有和不含有B染色体的两种玉米 (ZeamaysL .)基因组进行了RAPD分析 ,筛选到一个B染色体特异性分子标记B480。该标记与玉米的自主复制起始序列ARS1和ARS2同源 ,特别是该序列中的 2 5bp出现在多种模式生物基因组中。FISH的结果显示 。

依据图谱克隆技术在植物病理学上的应用前景

基因克隆正在开始改变我们对植物—病原物相互作用的分子机制的认识。最近,已经克隆并鉴定了控制复制、寄主范围和转移的植物病毒基因和控制无毒、寄主范围和诱发寄主过敏性反应的植物病原细菌基因。从植物病原真菌中,已经克隆了一些与病害相关的基因;同时,许多与寄主植物反应,如植物保卫素生物合成和细胞壁变性等有关的植物基因也已经被克隆。这些研究工作将有助于揭示在分子和细胞水平上的致病机制,并为培育抗病植物的全新策略指明途径。 1.

质粒Yp7构建的探讨

以大肠杆菌酵母穿梭质粒YRp7 DNA为材料,经体外重组构建了质粒Yp7。该质粒具有Amp^r、Tet^r两个抗药性标记和一个来自酵母细胞的Trpl基因。分子量约为5.25kb。该质粒可用于筛选水稻等真核生物DNA中的自主复制序列。

细胞内大片段DNA数据存储的多RS码交织编码

合成DNA作为潜在的数字信息存储介质,存储密度高,可用时间久,有望成为未来数据存储的重要选项。然而,DNA的合成与测序读出往往造成碱基的多种错误,无法满足数据存储的可靠性要求,而保证可靠性的编码方案往往效率较低。针对该问题,提出了一种面向酿酒酵母内大片段DNA数据存储的高效率编码方法。数据编码通过多个极高码率的里德-所罗门(RS)码的码字交织构建数据DNA单元,将其与酵母的自主复制序列(ARS)交替镶嵌,构成酵母人工染色体序列;数据读出时,利用二代高通量测序,组合了读段从头(denovo)组装、ARS导引例,用20×二代测序数据可无错恢复原始数据。该编码方法不仅能实现数据可靠存储,实现的DNA数据部分逻辑密度为1.973 bit/bp,即使考虑生物单元开销,总体逻辑密度仍达到1.947 bit/bp。该设计流程可支持Kb到Mb不同长度的DNA的编码,为大片段DNA数据存储的“湿”实验提供灵活的实验前验证与评估。

酵母的转化系统—生物技术的基本原理和应用

前言遗传工程的早期发展可能追溯到由 Griffith 等于1928年首先观察到和由 Avery 等于1944年证实的细胞外 DNA 转化肺炎球菌属(Pueumococcus),和能在预言部位上切割双链 DNA的限制性核酸内切酶的发现。转化真核生物的能力由 Hinnen

食品上的应用

892961 显微真菌在固态发酵中生物合成蛋白质.I.淀粉质原料富集蛋白质用的曲霉菌株的选育[英]/Czajkowska,D.…//ActaBiotechnol.-1988,8(5).-407～413[译自 DBA,1989,8(3)。