利用自体的人肝癌细胞系HCC-9724诱导特异性CTL

目的 :用自体的人肝癌细胞系诱导对肝癌细胞具有特异性杀伤作用的T淋巴细胞。方法 :分离肝癌患者外周血淋巴细胞 (PBL) ,在 5 0U/mlIL - 2存在下与经照射的自体肝癌细胞系共刺激 ,进行筛选性的混合淋巴细胞肿瘤细胞培养 (MLTC) ,直接免疫荧光法分析其细胞表型 ,51Cr释放试验检测效应细胞的杀伤效应。结果 :淋巴细胞明显增殖 ,细胞变大呈豆芽状。细胞毒性实验证明该细胞对HCC - 972 4有特异性杀伤作用 ,而对K5 6 2细胞没有杀伤作用。结论 :利用同体肝癌细胞系HCC - 972 4作为刺激细胞反复诱导肝癌患者能产生肝癌特异性的CTL。推测在刺激及培养条件适宜时 ,人外周血中较少的CTL前体细胞 (CTLp)

肝癌特异性靶标致敏DC诱导CIK细胞对肝癌HuH-7细胞及移植瘤的抑制

目的:观察负载肝癌特异性DC靶标的树突状细胞(dendritic cell,DC)与细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer cell,CIK)细胞共培养后对肝癌细胞HuH-7的杀伤作用以及对裸鼠肝癌移植瘤的治疗效果。方法:外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞。分别利用肝癌特异性DC靶标和肝癌HuH-7细胞冻融抗原刺激DC,ELISA法测定其对DC IL-12分泌的影响。DCHuH-7、DCtarget分别与CIK细胞共培养后,ELISA法检测其对CIK细胞IFN-γ分泌的影响,CCK-8法检测效靶比为10∶1、20∶1、40∶1、100∶1时DCHuH-7-CIK和DCtarget-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤作用。构建HuH-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、CIK组、DCHuH-7-CIK组和DCtarget-CIK组,尾静脉注射细胞悬液,观察效应细胞的抑瘤效果。结果:DCHuH-7与DCtarget的IL-12 p70分泌水平较DC显著升高[(179.33±14.04)、(173.33±6.66)vs(59.33±11.84)pg/ml,均P<0.01];与CIK细胞共培养后,DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK细胞分泌IFN-γ的能力也显著高于DC-CIK细胞(均P<0.01),且DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK细胞之间无显著差异(P>0.05)。在相同效靶比时,DCHuH-7-CIK细胞以及DCtarget-CIK细胞对HuH-7细胞的杀伤活性明显高于单纯CIK细胞(P<0.05),且DCHuH-7-CIK与DCtarget-CIK组之间无显著差异(P>0.05)。DCtarget-CIK细胞对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用与DCHuH-7-CIK细胞相仿,且均显著高于单纯CIK细胞[(78.48±14.58)%、(85.78±15.69)%vs(54.69±28.07)%,均P<0.05],无明显不良反应。结论:肝癌特异性DC靶标能够显著提高CIK细胞对HuH-7细胞及其裸鼠移植瘤的杀伤活性,可替代肝癌组织抗原负载DC。

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

DC荷载α-GalCer联合肿瘤特异性CTL对小鼠Heps肝癌移植瘤生长的影响

目的:探讨树突状细胞(DC)荷载α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)联合肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对小鼠Heps肝癌移植瘤生长的抑制作用。方法:诱导扩增小鼠骨髓来源的DC细胞和T淋巴细胞,培养成为具有肿瘤特异性的CTL,DC细胞体外荷载α-GalCer。建立Heps肝癌移植瘤模型,将36只模型鼠随机分为4组(n=9),分别尾静脉给予生理盐水(对照组)、CTL(CTL组)、DC荷载α-GalCer(DC荷载α-GalCer组)、DC细胞荷载α-GalCer+CTL(联合治疗组)输注。每隔两天测量移植瘤体积,观察体积变化。于治疗后第14d,处死小鼠,取眼球血及瘤体组织。流式细胞术(FCM)检测外周血CD4^+、CD8^+T细胞比例。免疫组织化学染色观察肿瘤组织中Bcl-2/Bax凋亡蛋白的表达。结果:与对照组相比,各治疗组均可抑制肿瘤的生长,差异具有统计学意义(P<0.01);联合治疗组较DC荷载α-GalCer组及CTL组肿瘤体积明显减小(P<0.05)。联合治疗组小鼠外周血CD4^+、CD8^+T细胞数量较另外三组显著升高(P<0.05);对照组、CTL组、DC荷载α-GalCer组小鼠外周血中CD4^+、CD8^+T细胞含量无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,各治疗组移植瘤内Bax阳性细胞数量明显增加(P<0.05),Bcl-2阳性细胞数量明显减少(P<0.05);与CTL组和α-GalCer组相比,联合治疗组移植瘤内Bax阳性细胞明显增加(P<0.05),Bcl-2阳性细胞明显下降(P<0.05)。结论:DC荷载α-GalCer与肿瘤特异性CTL联合应用能够对小鼠Heps肝癌移植瘤具有协同杀伤作用。

树突状细胞负载肝癌可溶性抗原后的免疫应答

目的用负载肝癌可溶性抗原的DC诱导肝癌特异性T细胞。方法在体外用GM-CSF和IL-4诱导健康人外周血单核细胞，使其分化为高纯 度树突状细胞（DC）。用负载人肝癌细胞株SMMC-7721可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞。结果诱导后淋巴细胞增殖指数大于1.5，表面CD56分子表达下降，CD3+ T / CD4+ T和CD3+ T / CD8+ T细胞比例增加，以CD3+ T / CD4+ T细胞比例增 加最为明显。CD4 / CD8比例由诱导前的0.84增加为1.04, 活化前后γ δ+ T比例没有改 变。活化后的淋巴细胞不但可杀伤SMMC-7721细胞，同时还可不同程度的杀伤其它3株肝癌 细胞。另外，诱导7 d的DC可不同程度的抑制4株肝癌细胞和胃癌细胞。结论实验结果为肝癌DC疫苗的研究提供了理论基础。

PHA及rhIL－2对新鲜分离肝癌细胞体外实验观察

本文从本院外科８例肝脏病人，合并肝门静脉高压行肝叶切除的肝组织，分离培养肝癌细胞。其中４例见肝癌细胞生长。对其中１例新鲜分离肝癌细胞中加入植物血凝素（ＰＨＡ）及重组人白细胞介素－２（ｒｈＩＬ－２），培养３天后发现，原来成片成堆生长的肝癌细胞逐渐减少，细胞结构破坏，７－９天后在细胞消失，周围淋巴细胞增多。未加ＰＦＡ及ｒｈＩＬ－２３例肝癌细胞生长旺盛，而周围淋巴细胞却逐渐减少消失。提示：ＰＨＡ及，ｒｈＩＬ－２对肝癌细胞周围淋巴细胞有刺激生长作用，对自体肝癌细胞有抑制作用。

肿瘤病人自体CIK和ECTL细胞治疗的护理

CIK为细胞因子诱导的杀伤细胞,是一种新型、高效,具有广谱杀瘤活性的免疫效应细胞,ECTL为肿瘤抗原特异性杀伤T淋巴细胞,是通过树突状细胞（DC）摄取、加工肿瘤抗原为抗原多肽提呈给T细胞,使T细胞被充分激活、增殖为CTL,启动细胞免疫机制,特异性杀伤肿瘤细胞。

DC负载肝癌相关抗原后诱导CTL的效应与机理研究

目的 :探讨DC负载肝癌相关抗原后诱导CTL的效应与机理。方法 :用GM -CSF和IL - 4从健康人外周血诱导DC ,使之负载肝癌相关抗原 ,用流式细胞术检测负载肝癌抗原后DC对自身淋巴细胞的活化 ;分别用MTT法和ELISA检测负载肝癌相关抗原后DC活化的淋巴细胞培养上清中TNF和IL - 1 2水平 ;用原位杂交检测淋巴细胞内IFN -γmRNA表达 ;用流式细胞术检测负载肝癌相关抗原DC活化后淋巴细胞表面Fas-L表达 ;最后检测负载肝癌相关抗原DC活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤及淋巴细胞培养上清对肝癌细胞的非特异性抑制。结果 :负载肝癌相关抗原DC在体外诱导活化的淋巴细胞在体外对肝癌细胞的杀伤以特异性CTL为主 ,同时分泌较高水平Th1型细胞因子IL - 1 2和TNF ,负载抗原DC活化的淋巴细胞培养上清对肝癌细胞也具非特异性抑制作用。结论

CpG寡核苷酸联合热固化瘤苗对肝癌细胞Hca-F荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的探讨CpG寡核苷酸(ODN)联合热固化瘤苗的抗肿瘤作用。方法剥取肿瘤,称重并计算抑瘤率;MTT法测免疫小鼠CTL、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性;ELISA法测免疫小鼠血清中IL-10、IL-12水平。结果联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以诱导荷瘤小鼠的抑瘤作用,其抑瘤率与单独使用瘤苗或CpGODN比较差异有显著性;联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠NK、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性,与单独使用瘤苗组相比较,差异具有显著性,但与单独使用CpGODN组相比较,NK、Mψ细胞的体外杀伤活性差异无显著性;联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠血清中IL-12水平并降低血清中IL-10水平,与二者单独使用组比较差异都具有显著性。结论联合使用CpGODN和热固化瘤苗能显著提高机体的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能。

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对肝癌特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的影响

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是体内最主要的免疫调节细胞，研究发现多种肿瘤患者的外周血及肿瘤局部均有Treg的比例增高，提示Treg在肿瘤的发生发展过程中可能起重要的作用。树突状细胞（DC）是目前已知的体内最强的专职抗原呈递细胞，可在体内、外向T淋巴细胞呈递抗原，并诱发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。本实验用H22小鼠肝癌细胞（H22细胞）全细胞抗原致敏DC（抗原致敏DC），

肝癌热休克蛋白-抗原肽复合物的构建及诱导CTL反应的初步研究

目的:研究体外构建热休克蛋白-抗原肽复合物的方法,观察其在体外的抗肿瘤作用。方法:用经43℃热处理1小时的人肝细胞悬液,经过裂解液裂解,60%～80%饱和硫酸铵沉淀,用SephadexG-100柱制备,取分子量为70KD组份,Westernblot进行性质鉴定。应用多肽解离液处理该组份,SephadexG-25柱过滤获得未结合多肽的蛋白分子,使其在体外与肝癌抗原肽SLIVHLNEV结合,构建成热休克蛋白-抗原肽复合物。应用此复合物刺激树突状细胞,激活同源外周血T淋巴细胞产生肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞(CTL),应用MTT法检测其对T2细胞及肿瘤细胞的杀伤活性。结果:所得蛋白经电泳及Westernblot进行蛋白分子量及性质鉴定为热休克蛋白70。SephadexG-25柱双分离法证实应用上述方法成功构建了肝癌热休克蛋白70-抗原肽复合物,用该复合物负荷树突状细胞在体外可以诱导出较强的肝癌抗原肽特异性CTL,可以杀伤负荷有该肽的T2细胞及递呈该肽的肿瘤细胞系。结论:体外构建的热休克蛋白-抗原肽复合物可以增强抗原肽诱导CTL反应能力,热休克蛋白是良好的T细胞免疫佐剂,有可能在肿瘤疫苗治疗中发挥重要作用。

肝癌疫苗的研究现状和进展

近些年来,肝癌疫苗备受关注,已成为肝癌免疫治疗的研究热点之一。运用肝癌细胞、肝癌抗原、树突状细胞及核酸等为基础构建的肝癌疫苗,通过激发机体的免疫系统,诱导机体产生针对肝癌特异性抗原的免疫应答,达到杀灭表达肝癌抗原的肿瘤细胞而产生抗肿瘤效应的目的。通过临床试验发现,肝癌疫苗可减少肝癌的复发转移、改善患者生存质量以及延长存活时间,已成为肝癌综合治疗的重要部分。

膀胱肿瘤细胞mRNA致敏的树突状细胞体外抗肿瘤免疫反应

目的:研究小鼠膀胱癌BTT739细胞mRNA致敏的树突状细胞(DC)诱导特异性的抗肿瘤免疫反应。方法:使用rmGM-CSF和rmIL-4培养诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,从BTT739细胞中提取mRNA致敏DC,与小鼠淋巴细胞混合培养以诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。采用MTT比色法和软琼脂法检测CTL对BTT739细胞的杀伤作用。结果:MTT比色法和软琼脂法检测结果显示:在靶细胞∶效应细胞不同浓度组中,BTT739实验组和对照组的OD值和肿瘤集落形成个数都有显著性差异(P<0 01,P<0 05),在靶细胞∶效应细胞的比例为1∶5、1∶25、1∶50和1∶100时,其杀伤率分别为25. 0%、36 .1%、45 .9% 和58 .2%;当效应细胞作用于AGS细胞时,其OD值无显著差异。结论:以膀胱肿瘤细胞mRNA致敏DC诱导CTL可有效杀伤膀胱肿瘤细胞。

树突状细胞活化的CTLs对神经胶质瘤的体外杀伤作用研究

目的研究负载肿瘤抗原的树突状细胞(DCs)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对神经胶质瘤细胞的体外杀伤效应,探讨其用于临床治疗的可行性。方法体外原代培养胶质瘤细胞,冻融法获取胶质瘤细胞抗原,联合应用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4和肿瘤坏死因子-α等,对人外周血单核细胞进行体外诱导来获取DCs并负载肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,制备特异性CTLs,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤的杀伤作用显著高于对K562细胞的杀伤作用(P<0.01),并且杀伤活性随着效靶比的增加而增加;负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤的杀伤活性明显高于未经胶质瘤抗原致敏的DCs刺激的CTLs对胶质瘤的杀伤作用(P<0.01)。结论联合应用细胞因子从人外周血中诱导出的DCs负载胶质瘤抗原后,激活的CTLs在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异的杀伤作用,为临床应用DCs瘤苗奠定基础。

多聚乙烯基亚胺介导的pOSP1-HSVtk基因对卵巢癌的抗瘤研究

目的:研究多聚乙烯基亚胺(PEI)介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌的扰肿瘤作用。方法:(1)将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSP1-HSVtk利用PEI导入人卵巢癌细胞SKOV3,人肺癌细胞NCI-H460和人肝癌细胞HepG2,MTT法测定GCV对三种肿瘤细胞的杀伤作用;(2)建立卵巢癌移植瘤模型,瘤周注射PEI/pOSP1-HSVtk复合物,通过HPLC监测体内GCV浓度的变化来评价TK基因在肿瘤组织中的表达效率;同时记录裸鼠的体重、瘤体大小及瘤重,计算体积和重量抑瘤率,并进行肿瘤组织的病理学和TUNEL检测。结果:(1)GCV仅对SKOV3细胞:具有杀伤作用;(2)与对照组相比,GCV的浓度在转染pOSP1-HSVtk的肿瘤组织局部显著降低(0.05>P>0.01);治疗组的肿瘤体积和瘤重显著减小(P<0.01),体积抑瘤率与重量抑瘤率分别为63.66%和58.98%。组织学示治疗组肿瘤细胞有出血及坏死,TUNEL证实了细胞的凋亡。结论:多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因对卵巢癌有靶向杀伤作用。

主要组织相容性复合体(MHC)多聚体技术的研究现状及应用

淋巴细胞是一群极为复杂的不均一细胞，它包括许多形态相似而表面标志和功能各不相同的细胞群与亚群。选择性地分离出均质性的特殊淋巴细胞群及亚群，对深入研究免疫细胞的结构、分化过程、生物学特性与功能，以及研究某些疾病的发病机制及诊断、治疗等具有重要的理论与临床意义。目前国内外大都根据细胞的表面标志、理化性状及功能的不同，对淋巴细胞进行选择性分离。尤其抗原特异性T细胞在控制感染和保护性免疫应答以及抗肿瘤效应和自体免疫综合征等疾病中都具有重要的作用。

医学免疫学

9828394 HLA二类区重组的特性/Cullen M∥Am J Hum Genet.-1997,60(2).-397～407 哈医图9828395 H-2D^p 转基因在靶和效应细胞水平改变了自然杀伤细胞的特异性:与H-2D^d转基因进行比较/Sentman C L∥JImmunol.-1996,156(7).-2423～2429四军大9828396 人 SNRPN 基因结构的 DNA甲基化和表达/Glenn C C∥Am J