自切割核酶介导的转基因淋巴细胞有效抑制猴免疫缺陷病毒的感染和致病

目的 获得抗猕猴免疫缺陷病毒 (SIV)转基因的淋巴细胞。方法 将锤头型核酶切割的一段靶序列连接在核酶下游构成自切割核酶 ,人工合成的自切割核酶基因扩增并克隆在pBluescriptSK的XhoI SalI位点 ,通过连续 4次克隆获得 10拷贝核酶基因的载体。转染前测定自切割核酶的体外活性并将之转移至哺乳动物表达载体上 ,脂质体法转染含核酶基因的表达载体 ,转染细胞在含 40 0mg/LG418的培养介质中筛选。转基因细胞对猴免疫缺陷病毒的抗性通过免疫荧光测定来估测。结果 37℃孵育 15min后 85 %的十体核酶自切割成单体核酶。在初始 2 5min的反式切割反应中尽管10体核酶摩尔数不足单体核酶十分之一 ,但十体核酶平均超过单体核酶 13 31%的切割产物。Northern点杂交证明单体核酶基因和十体核酶基因已经转入细胞并在细胞中获得表达。SIV攻毒试验表明 ,SIV接种 6d后转染单体核酶基因的细胞生长正常 ,不出现融合细胞 ,绝大多数转染十体基因的细胞生长良好 ,只发现极少数的融合细胞 ;转染单体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率达到10 0 % ,转染十体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率为 91 2 % ,转空表达载体细胞为 48%。结论 转自切割核酶基因的细胞对SIV的感染和致病均表现较强的抗性 ,但单体核酶比