产L-5-甲基四氢叶酸工程菌自动诱导培养基的优化

考察了自动诱导培养基代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)培养基诱导四氢叶酸还原酶在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,对自动诱导培养基自诱导时的乳糖浓度和葡萄糖添加量进行优化,并与IPTG诱导培养基进行比较,确定了自动诱导培养基配方:葡萄糖1.8 mmol/L、乳糖3 mmol/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10 g/L。HPLC结果显示,自诱导与IPTG诱导条件下的L-5-甲基四氢叶酸产量接近。

具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化

目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。