UTP经PLC-IP_3信号通路调控猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流

本文采用全细胞穿孔膜片钳技术研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)的作用,探讨细胞内Ca2+释放在UTP产物三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate, IP3)调控STOCs过程中的作用机制。结果显示:(1)UTP(40 μmol/L)可明显激活CASMCs的STOCs,使其幅度和频率分别增加(57.54±5.34)% 和(77.46±8.42)% (P<0.01, n=38)。(2)磷脂酶C(phospholipase C, PLC)阻断剂U73122(5 μmol/L)可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.04±7.46)%和(41.65±16.59)%(P<0.05, n=10);细胞外再加入UTP 不能再次激活STOCs (n=7)。(3)L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+ channels, L-VDCCs)阻断剂verapamil (20 μmol/L)和CdCl2(200 μmol/L)几乎不影响UTP对STOCs活性的调节(n=8)。 (4)1 μmol/L 的bisindolylmaleimide I [BisI,蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的特异性阻断剂]可明显激活 STOCs,使其幅度和频率分别增加(65.44±24.66)%和(61.35±21.47)%(P<0.01,n=12),细胞外再加入UTP (40 μmol/L)可使STOCs的幅度及频率进一步明显增加(P<0.05,P<0.01,n=12),细胞外继续加入ryanodine (50 μmol/L)则可完全阻断STOCs。(5)UTP(40μmol/L)预处理细胞后,IP3受体(IP3 receptors, IP3Rs)阻断剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB,40μmol/L)可使STOCs的幅度降低(24.08±3.97)%(P<0.05, n=8),对其频率的影响较小(n=8) ;而80 μmol/L的2-APB则可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.43±6.34)%和(40.59±19.01)%(P<0.05, P<0.01, n=6),细胞外继续加入高浓度的ryanodine(50 μmol/L)可完全抑制STOCs(n=6)。用2-APB (40 μmol/L)或ryanodine(50 μmol/L)预处理细胞后,UTP(40 μmol/L)不能再次激活 STOCs。以上结果提示:UTP主要通过PLC-IP3信号通路激活急性酶分离的猪CASMCs的STOCs,IP3Rs和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的细胞内Ca2+释放在此过程中发挥重要作用。

雌激素对正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流的作用

目的研究雌激素(estrogen,E)对正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的作用,探讨雌激素对该细胞上大电导钙激活钾通道(Large-conductance Ca2+-activated potassiumchannels,BKCa)的作用机制。方法用急性酶分离方法分离人肠系膜血管平滑肌细胞,采用全细胞穿孔膜片钳技术记录该细胞上的自发性瞬时外向电流。结果雌激素可浓度依赖性地激活正常人肠系膜血管平滑肌细胞上的STOCs,当雌激素浓度从0μM增加到10、70、200、300μM时,其幅度和频率都增加,其中幅度分别增加了(68.15±10.82)%(n=10,P<0.01)、(131.63±35.33)%(n=10,P<0.01)、(192.02±57.85)%(n=10,P<0.01)、(269.34±70.64)%(n=10,P<0.01);频率分别增加了(29.30±8.61)%(n=10,P<0.01)、(89.17±21.76)%(n=10,P<0.01)、(164.33±43.51)%(n=10,P<0.01)、(205.09±62.49)%(n=10,P<0.01)。结论雌激素可直接激活正常人肠系膜血管平滑肌细胞自发性瞬时外向电流,是通过增加其幅度和频率而激活的,为进一步探讨雌激素对大电导钙激活钾通道的作用机制提供了实验依据。

动脉平滑肌细胞内钙瞬变与自发性瞬时外向电流同步记录技术(英文)

本文旨在建立一种可同步观察细胞内信号分子和细胞膜离子通道变化之间相互关系的实时研究方法。联合应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)显微成像技术和全细胞穿孔膜片钳技术,在急性酶分离的小鼠脑动脉平滑肌细胞上同步记录自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)和细胞内的钙瞬变。在全细胞模式膜片钳记录平滑肌细胞膜钾电流的同时,LSCM可准确记录到胞浆内出现的钙瞬变。此技术对于从分子水平揭示细胞内信号转导过程和离子通道相关疾病的机制有重要意义。

细胞内钙动员对猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流的调节

为研究急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的基本特性及其调节,采用全细胞穿孔膜片钳技术记录STOCs的变化.结果发现,STOCs具有明显的电压依赖性,随机地叠加在全细胞大电导钙激活钾通道(large Ca2+-activated-K+channels,BKCa)电流上,BKCa通道的特异性阻断剂卡律蝎毒素(charybdotoxin,ChTX)200nmol/L可完全抑制STOCs的活性.逐步降低细胞外Ca2+浓度可明显抑制STOCs活性直至完全消失,而钙离子载体A23187(10μmol/L)可明显增强STOCs的活性.L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent calcium channels,L-VDCCs)阻断剂维拉帕米(20μmol/L)和氯化镉(200μmol/L)对STOCs的活性却没有明显影响.兰诺定受体(ryanodine receptors,RyRs)的特异性激动剂咖啡因(5mmol/L)能够明显激活STOCs,而其阻断剂兰诺定(ryanodine,50μmol/L)却可以使其不可逆性完全抑制;随后再应用咖啡因(5mmol/L)不能再次激活STOCs.三磷酸肌醇受体(inositol1,4,5-trisphosphate receptors,IP3Rs)阻断剂2APB(40μmol/L)也可明显抑制STOCs的活性,继而使用咖啡因(5mmol/L)仍可激活STOCs.结果表明:猪冠状动脉平滑肌细胞的STOCs是由BKCa通道介导的,细胞外Ca2+对于STOCs的产生是必需的,而L-VDCCs介导的Ca2+内流不影响STOCs的活性,RyRs是STOCs产生的最终通路,IP3Rs也可能参与了STOCs的调控.

一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的:探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法:以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(big-conductance Ca2+-activated potassium channels,BKCa)宏观电流以及自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。

有氧运动对高血压大鼠脑动脉平滑肌细胞STOCs的影响

目的:观察有氧运动对自发性高血压大鼠(SHR)脑动脉平滑肌细胞自发瞬时外向电流(STOCs)的影响。方法:选用雄性SHR 24只,随机分为高血压安静组(SHR-SED组)和高血压运动组(SHR-EX组),后者进行8周有氧跑台运动。另选用同龄雄性WKY大鼠12只作为正常血压对照组。8周后,取脑动脉,用酶消化法急性分离脑动脉平滑肌细胞。采用穿孔膜片钳实验记录各组大鼠脑动脉STOCs的变化。结果:(1)SHR-SED组基础收缩压显著高于WKY组,经过有氧运动训练后收缩压显著下降,但仍较WKY组高(P<0.01)。(2)STOCs具有明显的电压依赖性,可被1 m M caffeine激活而被100 n M IBTX阻断;(3)在相同钳制电位下,自发性高血压可以显著增加脑动脉平滑肌细胞的STOCs的幅值,而频率无显著性改变。(4)有氧运动显著降低由高血压导致的STOCs幅值增高,而对频率无显著性影响。结论:自发性高血压大鼠脑动脉平滑肌细胞STOCs的幅值显著增大,与高血压背景下大电导钙激活钾通道(BKCa)功能的代偿性增强有关;长期有氧运动可以显著抑制此增强效应,阻止高血压背景下的BKCa通道的病理性改变。

有氧运动抑制衰老大鼠脑动脉平滑肌STOC/BK_(Ca)功能下调

目的探讨有氧运动训练对衰老大鼠脑动脉平滑肌细胞全细胞K＋电流、自发瞬时外向电流及大电导钙激活钾通道生物物理特性的影响。方法 19~21月龄雄性Wistar大鼠12只（老年组）,随机分为安静组和有氧运动组,并选用2月龄Wistar大鼠安静处理作为青年对照组。12周后取脑动脉,急性分离动脉平滑肌细胞。分别采用膜片钳全细胞模式、穿孔膜片钳模式和单通道内面向外模式观察运动对全细胞K＋电流、自发瞬时外向电流和大电导钙激活钾通道门控特性的影响。结果安静组全细胞K＋电流密度及对Iberiotoxin敏感性降低;安静组自发瞬时外向电流幅值降低,频率无明显变化;安静组大电导钙激活钾通道平均开放概率和平均开放时间显著低于青年对照组,而平均关闭时间高于青年对照组;电压依赖性和钙敏感性亦显著下降;与安静组相比,有氧运动可以增加全细胞K＋电流密度、自发瞬时外向电流幅值及大电导钙激活钾通道平均开放概率、电压依赖性和钙敏感性来实现对大鼠脑动脉平滑肌自发瞬时外向电流/大电导钙激活钾通道功能的保护作用。结论长期规律有氧运动可以减弱衰老所致的大鼠脑动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道功能下调,这可能是有氧运动改善衰老动脉功能的重要机制之一。

雌激素对高血压人体肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用研究

目的 研究雌激素（E）对非高血压（NH）及原发性高血压（EH）人体肠系膜动脉平滑肌细胞（HMASMC）大电导钙激活钾通道（BKCa channels）及自发性瞬时外向电流（STOCs）的作用,探讨雌激素在NH及EH下对该通道作用的差异性.方法 急性酶分离法分离获取单个HMASMC,采用全细胞穿孔膜片钳技术记录该细胞上的BKCa和STOCs.结果 雌激素可明显激活NH组HMASMC上的BKCa和STOCs,在测试电压范围内,雌激素使膜电位从0到＋60 mV时BKCa的电流密度均显著性增加,在0和＋60 mV时其电流密度分别从（1.95±0.39）pA/pF、（15.40±4.27）pA/pF增加到（2.81±0.84）pA/pF（P＜0.05,25例）、（26.55±6.24）pA/pF（P＜0.01,25例）,其中0 mV时增加了0.44倍,＋60 mV时增加了0.72倍;电位为-20 mV时STOCs的幅度和频率分别从（7.920±2.031）pA、（3.15±0.79）Hz增加到（12.92±3.41）pA（P＜0.05,25例）、（4.41±0.96）Hz（P＜0.01,25例）,其中幅度增加了0.63倍,频率增加了0.40倍.而EH组在测试的-60到＋50 mV电压范围,雌激素没有这种显著性激活作用,在0和＋60 mV时其电流密度分别从（1.34±0.43）pA/pF、（4.91±1.40）pA/pF增加到（1.53±0.55）pA/pF（P＞0.05,14例）、（8.04±2.0）pA/pF（P＜0.05,14例）,其中0 mV时增加了0.14倍,＋60 mV时增加了0.63倍;在电位为-20 mV时STOCs的幅度和频率分别从（5.39±1.93）pA、（0.75±0.37）Hz增加到（6.70±1.06）pA（P＞0.05,14例）、（2.34±0.98）Hz（P＜0.05,14例）,其中幅度增加了0.24倍,频率增加了2.12倍.结论 雌激素对NH组HMASMC上的BKCa和STOCs有明显的激活作用,而在EH组这种激活作用显著降低,由此推测EH组HMASMC对雌激素的反应性较NH组低,这种差异性将为雌激素合理应用于临床提供有力的实验依据.关键词：高血压;雌激素;人体肠系膜动脉;平滑肌细胞;自发性瞬时外向电流;

平滑肌肌浆网Ca^(2+)释放与STOCs相关性的研究进展

平滑肌细胞肌浆网(SR)上存在两种不同类型的钙释放通道:三磷酸肌醇敏感的钙释放通道(IP3R)和ryanodine敏感的钙释放通道(RyRs)。肌浆网产生的局部瞬时钙释放如钙火花或Ca2+puffs激活邻近胞膜上的钙激活钾通道产生自发性瞬时外向电流(STOCs)。近来研究表明IP3Rs和RyRs都参与肌浆网内钙的调节和平滑肌的舒张。这两种释放通道是否存在协同作用,以及如何影响STOCs,进而调控平滑肌的舒缩活动,不同组织存在很大差异。本文就此方面的研究进展进行综述。

穿孔膜片钳记录肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道方法初探

目的利用穿孔全细胞膜片钳技术以提高记录到稳定的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channels,BKCa)电流的成功率。方法在两性霉素B穿孔全细胞膜片钳下记录大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa宏观电流和自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)。结果采用两性霉素B穿孔全细胞膜片钳技术,记录到BKCa和STOCs概率明显增加,且可以维持3小时。结论通过穿孔全细胞膜片钳可以记录到稳定的且维持时间长的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa电流。