清燥救肺汤调控AMPK通路诱导Lewis荷瘤小鼠肺癌细胞自噬体膜及溶酶体形成的机制探讨

目的基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路探讨清燥救肺汤诱导Lewis荷瘤小鼠肺癌细胞自噬体膜及溶酶体形成的机制。方法将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为模型组、环磷酰胺(CTX)组(50 mg·kg^(-1))、清燥救肺汤组(11 g·kg^(-1))、AMPK抑制剂组(Compound C,10 mg·kg^(-1))及清燥救肺汤+AMPK抑制剂组(11 g·kg^(-1)清燥救肺汤+10 mg·kg^(-1)Compound C)。各组小鼠均右腋皮下注射Lewis肺癌细胞构建肺癌荷瘤模型。清燥救肺汤组和清燥救肺汤+AMPK抑制剂组需造模前14 d开始灌胃清燥救肺汤(11 g·kg^(-1)·d^(-1))。造模24 h后,CTX组以50 mg·kg^(-1)CTX隔日腹腔注射1次,共7次;AMPK抑制剂组和清燥救肺汤+AMPK抑制剂组均腹腔注射Compound C(10 mg·kg^(-1)·d^(-1)),清燥救肺汤组和清燥救肺汤+AMPK抑制剂组继续按照设定剂量灌胃清燥救肺汤(11 g·kg^(-1)·d^(-1)),连续14 d。采用Western Blot法检测肺癌组织自噬体膜形成相关蛋白[自噬关键分子酵母ATG6同系物(Beclin-1)、磷酸化自噬关键分子酵母ATG6同系物(p-Beclin-1)、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(VPS34)、磷酸化Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(p-VPS34)]的表达水平;RT-q PCR法检测肺癌组织中自噬相关蛋白9A(ATG9A)、乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)、转录因子增强子3(TFE3)m RNA表达水平;免疫荧光双重染色法检测肺癌组织中自噬蛋白微管相关蛋白轻链3B(LC3B)及P62蛋白表达情况。结果与模型组比较,清燥救肺汤组和CTX组小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1蛋白表达水平及p-Beclin-1/Beclin-1比值显著升高(P<0.05,P<0.01),VPS34、p-VPS34蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著升高(P<0.05,P<0.01),ATG9A、ACSS2 m RNA表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01),TFE3 m RNA表达水平显著降低(P<0.01),LC3B蛋白荧光强度表达水平显著升高(P<0.01),P62蛋白荧光强度表达水平显著降低(P<0.01)。与清燥救肺汤组比较,清燥救肺汤+AMPK抑制剂组小鼠肺癌组织中p-Beclin-1蛋白表达水平及p-Beclin-1/Beclin-1比值显著降低(P<0.05,P<0.01),VPS34、p-VPS34蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著降低(P<0.05,P<0.01),ATG9A、ACSS2 m RNA表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),TFE3 m RNA表达水平显著上升(P<0.01),LC3B蛋白荧光强度表达水平显著降低(P<0.01),P62蛋白荧光强度表达水平明显升高(P<0.05)。与AMPK抑制剂组比较,清燥救肺汤+AMPK抑制剂组小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1蛋白表达水平显著升高(P<0.01);VPS34、p-VPS34蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著升高(P<0.01);ATG9A、ACSS2 m RNA表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论清燥救肺汤诱导肺癌细胞自噬体膜及溶酶体形成的机制可能是通过激活Beclin-1、VPS34蛋白,上调ATG9A、ACSS2 m RNA表达,抑制TFE3 mRNA表达实现的。

昆虫细胞自噬的生物学意义和自噬体膜的来源

细胞自噬(autophagy)是生物体广泛存在的细胞内自主降解过程。该过程通过自我吞噬细胞质成分和细胞器形成具有双层膜结构的自噬体,与溶酶体融合实现细胞内物质的循环利用。细胞自噬在饥饿、缺氧、内质网胁迫、病原入侵、蛋白聚集等不良环境条件下实现自我挽救,而细胞自噬的大量发生也是程序性细胞死亡(PCD)的启动和执行者之一。目前人们对自噬体分子组装和自噬发生的分子通路已有较深入的了解,但仍然在很多重要问题上难以达成共识。本文结合我们的研究进展,对昆虫细胞自噬的生物学意义和自噬体膜的来源问题进行综述和探讨。昆虫在营养相对匮乏的情况下发生低水平自噬(常态自噬),用于维持细胞内的新陈代谢和继续生存的需要。昆虫在摄食阶段受到过度饥饿的刺激,在变态发育时期受到蜕皮激素(20E)的诱导,幼虫组织细胞发生高水平自噬和凋亡(apoptosis),细胞表现为不可逆死亡,过度饥饿导致幼虫发育迟缓或者死亡,而20E导致幼虫蜕皮和幼虫组织退化或消亡。不同于酵母和高等动物细胞中的深入研究,病原入侵是否和如何诱导昆虫细胞发生自噬,目前尚缺乏足够的文献依据,值得深入探讨。几乎所有的细胞器(内质网、高尔基体、线粒体)膜都可能是自噬体膜的来源,这一问题在昆虫中也有待进一步诠释。

自噬体膜的来源

细胞自噬是指细胞通过自噬-溶酶体(autolysosome)降解变性蛋白聚集物和受损细胞器的过程.自噬对于细胞内环境的稳态、物质的平衡、胚胎发育以及疾病的发生发挥重要作用.在电镜下观察,自噬体膜是一个双层脂质膜结构.细胞中因缺乏除了自噬相关蛋白9(autophagy-related protein 9,ATG9)以外的自噬体膜相关蛋白,故难以确定自噬体膜的来源.自噬体膜的来源也因此成为目前自噬研究领域的热点问题.关于自噬体膜的来源,学术界存在两种观点:一种认为自噬体膜是细胞在自噬体组装位点(pre-autophagosomal structure,PAS)重新合成的;另一种观点则认为自噬体膜来源于细胞已有的某些细胞器(如内质网、高尔基体、内吞体、质膜和线粒体).该文综述了近年有关自噬体膜来源于细胞已有的某些细胞器的研究进展,旨在为相关领域的研究提供参考.