线粒体自噬受体Nix蛋白的原核表达及其纯化

目的获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度及构象均一的Nix蛋白。方法将Nix截断基因构建到原核载体并转化大肠杆菌。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后通过GST柱亲和纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析进一步纯化。结果 Nix截断基因成功构建到p GEX-4T-2并诱导表达了目标蛋白。通过GST亲和层析得到了可溶性的携带GST标签的Nix（2∽135）蛋白。切除GST标签的Nix（2∽135）通过凝胶过滤层析得到了构象均一的单体蛋白。结论采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得纯度高且构象均一的单体Nix蛋白。

内质网自噬受体1对胃癌细胞生物学功能的影响

目的内质网自噬受体1(FAM 134 B)在胃癌中的具体作用机制尚不明确。文中旨在研究FAM 134 B在胃癌细胞中表达上调对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,并分析FAM 134 B相关的信号通路及相互作用蛋白对FAM 134 B生物学功能。方法构建FAM 134 B过表达的小鼠胃癌MFC细胞系模型,将含有pcDNA3.1-FAM134B的MFC细胞系(FAM 134 B组)滴加到6孔板中继续培养;另于MFC细胞系中转染pcDNA3.1-vector质粒(对照组),1 d后行蛋白印迹实验评估质粒转染情况。通过细胞划痕实验检测FAM 134 B表达上调对胃癌细胞迁移的影响,通过CCK8法检测FAM 134 B表达上调对胃癌细胞增殖的影响,通过Transwell法检测FAM 134 B表达上调对胃癌细胞侵袭的影响,通过Annexin P/PI双染色法检测FAN134B表达上调对胃癌细胞凋亡的影响。最后利用基因富集分析和构建相互作用蛋白网络图对FAM 134 B相关生物学功能进行探索。结果FAM 134 B组细胞24 h后的愈合率[(48.333±7.095)%]较对照组[(72.667±4.509)%]明显降低(P=0.018)。FAM 134 B组A 450nm波长的密度值(0.643±0801)较对照组(1.071±0.783)明显降低(P=0.008)。FAM 134 B组细胞计数[(34.750±3.500)个]较对照组[(57.000±4.690)个]明显降低(P=0.001)。FAM 134 B组细胞凋亡数较对照组明显升高(P=0.007)。富集涉及178个基因集共56514个基因,随FAM 134 B表达水平上升而上调包括102个基因集,且FAM 134 B主要参与了32条信号通路(P<0.05,FDR<0.05)。结论FAM 134 B表达上调可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭,并促进胃癌细胞的凋亡,且FAM 134 B相关信号通路及相互作用蛋白密切参与肿瘤的进展,FAM 134 B可能成为胃癌诊疗过程中重要的靶点。

选择性自噬受体对SLE患者Ⅰ型IFN过表达调节的研究进展

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)也被称为Ⅰ型IFN特征性疾病,是一种病因不明的慢性全身性自身免疫性疾病。体内过度免疫应答和Ⅰ型IFN的过量表达为该病的主要特征。在固有免疫应答过程中,核酸感受器对于病原体及体内核酸的过度反应是导致患者体内Ⅰ型IFN异常的主要原因之一。调节体内过度免疫反应及Ⅰ型IFN的过量表达对于缓解病情有重要作用。自噬作为调控机体稳态的重要过程可以抑制Ⅰ型IFN应答。该文就选择性自噬受体三方基序蛋白21(tripartite motif 21,TRIM21)、干扰素基因刺激物(stimulator of interferon gene,STING)、p62通过介导多种信号通路中的关键调节因子的自噬来影响Ⅰ型IFN应答展开探讨。

线粒体自噬在乳腺癌发生发展中的作用及其调控机制

线粒体自噬是细胞通过自噬-溶酶体途径,在自噬相关蛋白的调控下,有选择地清除受损或功能障碍的线粒体以维持线粒体质量和细胞稳态的过程,与多种肿瘤的发生发展密切相关。越来越多研究表明,线粒体自噬在乳腺癌进展中发挥着双重作用。①促进乳腺癌进展:线粒体自噬通过触发能量代谢重编,减少ROS蓄积和维持线粒体稳态来促进乳腺癌细胞的生存和侵袭;②抑制乳腺癌进展:线粒体自噬通过减轻炎症反应和引发线粒体损伤,诱导乳腺癌细胞死亡或凋亡。其相关机制包括①PTEN诱导的激酶1/E3泛素蛋白连接酶(PINK1/Parkin)途径;②线粒体自噬受体相关蛋白途径(包括BNIP3、BNIP3L和FUNDC1);③线粒体分裂途径。本综述总结了线粒体自噬在乳腺癌中的作用、机制以及化疗耐药的研究现状,旨在为乳腺癌的研究和治疗提供参考。

内质网应激诱导内质网自噬的分子机制

内质网应激是细胞在应对缺氧、营养缺乏等情况时产生的保护性应激反应,通过诱导未折叠蛋白质反应的3条通路来缓解内质网的蛋白质堆积。内质网应激通过内质网自噬受体诱导的内质网自噬,是降解不易被未折叠蛋白质反应途径降解的未折叠或错误折叠的蛋白质,以及恢复内质网形态结构的重要途径。哺乳动物和酵母细胞中存在多种内质网自噬受体,主要功能为促进内质网碎片的形成,并捕获自噬底物,将内质网碎片和未折叠或错误折叠的蛋白质递送至自噬溶酶体中进行降解。每种内质网自噬受体具有独特的结构导致它们捕获自噬底物的方式不尽相同;同时,内质网应激通过不同的途径调控内质网自噬受体的表达和磷酸化。因而,内质网应激通过不同的分子机制激活内质网自噬受体介导的内质网自噬。此外,内质网应激介导的内质网自噬在许多人类疾病的发生发展中发挥重要的作用。阐明内质网应激诱导内质网自噬的具体机制,为内质网自噬相关疾病的防治提供理论依据。因此,本文将综述内质网应激启动哺乳动物细胞中内质网自噬受体FAM134B、RTN3L、SEC62、CCPG1和酵母细胞中内质网自噬受体Atg39、Atg40、Erp1介导的内质网自噬的分子机制,以及内质网应激诱导的内质网自噬与神经退行性疾病和肿瘤等人类疾病的联系,为内质网自噬相关疾病的防治提供新策略。

泛素信号途径、自噬受体与细胞选择性自噬

蛋白质泛素化是真核生物细胞内蛋白质合成后最重要和最普遍的修饰方式之一。发生在蛋白质底物上的泛素化,由于其泛素化方式及形成泛素链的连接形式的多样性,又统称为泛素信号途径。研究表明,泛素信号途径对蛋白质的调节作用分为降解相关和非相关的两种。细胞内蛋白质的降解主要通过泛素-蛋白酶体或溶酶体-自噬途径来完成。一般认为,通过泛素-蛋白酶体降解的蛋白质具有很强的选择性,而通过溶酶体-自噬途径降解的蛋白质一般选择性较差。然而,近年来,细胞自噬受体如p62等的发现则表明细胞自噬同样具有很强的选择性,这一类由细胞自噬受体介导的细胞自噬被称为细胞选择性自噬(Selective autophagy)。蛋白质泛素化及降解调控几乎所有类型的细胞活动;与之对应的是,蛋白质泛素化及降解异常与包括肿瘤在内的多种人类疾病的发生发展密切相关。本文综述了泛素信号途径调控蛋白质通过蛋白酶体或自噬途径降解的基本过程和部分最新进展,并结合本实验室的研究成果介绍泛素化修饰细胞自噬受体调控细胞选择性自噬的新机制。

线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化

[目的]获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度Bnip3蛋白。[方法]将Bnip3截断基因构建到原核表达载体上并转化大肠杆菌。IPTG诱导表达后通过GST柱纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析纯化Bnip3蛋白。[结果]Bnip3截断基因重组体成功构建并诱导表达目标蛋白。通过GST亲和层析得到可溶性的携带GST标签的Bnip3（1~111）和Bnip3（1~152）蛋白。切除GST标签的Bnip3（1~152）通过凝胶过滤层析得到构象均一的二聚体蛋白。[结论]采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得构象均一的高纯度二聚体Bnip3蛋白。

选择性自噬受体TAX1BP1的研究进展及意义

自噬是真核细胞内主要的降解系统之一,在清除细胞内受损物质方面发挥着重要作用。近年来,自噬与疾病的关系成为研究的热门话题。自噬功能的异常往往影响着疾病的发生、发展及预后。细胞通过自噬途径选择性地清除某些细胞质成分的过程称为选择性自噬。选择性自噬的发生通常需要自噬受体的参与,不同的自噬受体发挥的具体功能也不尽相同。其中,Tax1结合蛋白1(Tax1-binding protein 1,TAX1BP1)作为选择性自噬接头蛋白的一员,主要由一个SKIP羧基同源性域(SKIP carboxyl homology,SKICH)、一个微管相关蛋白I轻链3结合结构域(LC3-interacting region,LIR)、三个卷曲螺旋和一个羧基末端泛素锌指结合(ubiquitin-binding zinc finger,UBZ)结构域构成。这些结构域介导了TAX1BP1与其他蛋白质的相互作用,并在一定程度上对TAX1BP1在细胞中的功能产生影响。TAX1BP1同时调节NF-κB、JNK等信号通路;它广泛地参与到线粒体自噬、异体自噬以及溶酶体自噬等自噬进程中去;TAX1BP1的异常表达与炎症反应、恶性肿瘤及循环系统疾病的发生密切相关。该文主要对TAX1BP1的结构功能、调节的信号通路、与自噬的关系,以及其生理意义进行系统的总结,为今后TAX1BP1的研究提供新思路。

植物ATG8结合蛋白

ATG8(自噬相关蛋白8)结合蛋白通过ATG8相互作用基序(ATG8 interaction motif,AIM)或泛素相互作用基序(ubiquitin interaction motif,UIM)与ATG8相互作用,在自噬、选择性自噬和非自噬过程中起关键作用。ATG8结合蛋白在酵母和哺乳动物研究中取得了巨大进展,但在植物领域仍然滞后。本文首先概括了植物ATG8蛋白结构及特征,其次,重点阐述了作为植物选择性自噬受体的ATG8结合蛋白的结构和功能,最后,总结了参与自噬小体闭合、转运和人工合成ATG8结合蛋白研究状况。本文结合最新研究,系统总结了目前发现的植物ATG8结合蛋白结构和功能,以期为植物选择性自噬和自噬的研究提供新思路。

NBR1、TTN 蛋白表达水平与膀胱癌患者临床特征、预后的关系

目的探讨自噬受体(NBR1)、肌联蛋白(TTN)水平与膀胱癌患者临床特征、预后的关系。方法回顾性分析2018年6月至2020年5月信阳市人民医院收治的70例膀胱癌患者的临床资料,将患者的癌组织标本纳入膀胱癌组,对应癌旁组织标本纳入癌旁组。采用免疫组化法检测并比较两组标本组织的NBR1、TTN阳性表达率。分析NBR1、TTN表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系,采用多因素Cox回归分析法探讨膀胱癌患者预后的影响因素。结果膀胱癌组标本组织中的NBR1和TTN阳性表达率分别为74.29%、78.57%,明显高于癌旁组的40.00%、31.43%,差异均有统计学意义(P<0.05);浸润深度T_(3)~T_(4)期、高分化、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期患者NBR1阳性表达率明显高于浸润深度T_(1)~T_(2)期、中/低分化、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P<0.05);浸润深度T_(1)~T_(2)期、中/低分化、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、NBR1阴性、TTN阴性患者的3年生存率明显高于浸润深度T_(3)~T_(4)期、高分化、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、NBR1阳性、TTN阳性患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,高分化、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、NBR1阳性、TTN阳性均是膀胱癌患者预后的影响因素(P<0.05)。结论NBR1、TTN在膀胱癌中呈高表达,与浸润深度、TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关,有望作为评估膀胱癌患者预后生物标志物。

内质网自噬及其与疾病的关系研究进展

内质网自噬是指细胞通过选择性自噬清除内质网的过程。选择性清除应激的内质网以及内质网腔内过度聚集的蛋白质对于内质网的质量控制及细胞稳态非常重要。多种内质网自噬受体介导了内质网与自噬体的特异性结合,促进内质网片段被溶酶体降解。内质网自噬异常与多种疾病密切相关,因此研究内质网自噬的分子机制具有重要的生理及病理意义。该文对内质网自噬的机制及其与疾病的关系进行了综述。

异体自噬调控机制的研究进展

自噬(autophagy)是机体的自我稳定与保护机制,进化上高度保守,在各种生物细胞中广泛存在。在自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)的调控下,机体通过溶酶体降解自身的细胞器或大分子物质,以实现代谢需要、清除部分代谢废物或有害物质、更新某些细胞器、维持细胞内稳态。依照降解底物转运至溶酶体的途径,可将自噬分为巨自噬(mac-rophagy)、微自噬(microphagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)3种类型.

内质网自噬的作用机制

内质网自噬(endoplasmic reticulum autophagy,ER-phagy)是指调节内质网的碎片化并将其运送到溶酶体中降解的过程,其作用是降解多余的内质网膜,维持内质网质量和容量的稳态。介导ERphag y的受体包括FAM134B、RTN3、SEC62、TE X264及CCPG1。当机体发生细胞饥饿、内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)、非折叠蛋白聚集、细菌及病毒的感染等时,ERphag y就会显著增强。ER-phag y在细胞的生长发育、分化、炎症、免疫防御等过程中发挥重要作用。ER-phagy参与众多疾病的发生与发展,如心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病及感染性疾病。深入探索ER-phagy在疾病中的作用机制,研究干预ER-phagy对疾病的影响和预后转归具有重要的临床意义。

内质网自噬—内质网质量控制新途径

内质网是真核细胞的重要细胞器。在某些病理因素下,细胞内环境的变化可引起内质网应激,在内质网应激早期,内质网主要通过启动未折叠蛋白反应来缓解内质网压力,而长期持续的内质网应激将引起细胞凋亡。研究发现内质网自噬可以通过清除蛋白质聚合物及受损的内质网来恢复内质网稳态。作为一种新发现的选择性自噬,内质网自噬参与多种疾病的发生发展。

内质网自噬的研究进展

内质网自噬(endoplasmic reticulophagy or reticulophagy,ER-phagy)是选择性自噬新类型,其是由溶酶体介导的特异性清除受损内质网的过程,其主要功能是降解多余的内质网膜和难溶或有毒性的蛋白聚集体,控制内质网的体积,从而维持细胞稳态。本文简要介绍了内质网自噬的发现、作用和可能的激活方式,并阐述了自噬起始、自噬小体形成及自噬小体成熟的调控机制,最后归纳总结了内质网自噬受体的结构、功能及其医学意义。

DAPK-1与p62/SQSTM1在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中表达及临床意义

目的:探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK-1)和自噬受体蛋白p62(p62/SQSTM1)在早发型重度子癫前期(PE)患者胎盘组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学SABC法检测66例胎盘组织石蜡标本中DAPK-1和p62/SQSTM1的表达,其中早发型重度PE标本26例、晚发型重度PE 40例,正常孕妇30例(对照组)。结果:DAPK-1在对照组、晚发型重度PE组、早发型重度PE组中的阳性表达率分别为23.3%(7/30)、52.5%(21/40)、92.3%(24/26)有差异(P<0.05);早发型重度PE阳性表达较对照组、晚型重度PE组高(P<0.05);晚发型重度PE阳性表达较对照组高(P<0.05)。p62/SQSTM1在对照组、晚发型重度PE组、早发型重度PE中的阳性表达率分别为76.7%(23/30)、47.5%(19/40)、19.2%(5/26)有差异(P<0.05);早发型重度PE阳性表达较对照组、晚发型重度PE组低(P<0.05);晚发型重度PE阳性表达较对照组低(P<0.05)。DAPK-1和p62/SQSTM1的表达呈负相关(r=-0.505)。结论:DAPK-1与p62/SQSTM1可能与PE的发生发展和严重程度相关。

内质网自噬在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性进展性呼吸衰竭,它是危重患者发病和死亡的主要原因。关于ARDS的治疗方法,目前主要采用一般支持性治疗。内质网自噬(ER-phagy)通过选择性降解内质网片段和错误折叠蛋白来维持细胞稳态,并且它可以调节炎症反应和细胞凋亡,清除内质网腔的病原体,控制胶原蛋白质量。本文就ARDS研究现状、ARDS发病机制、内质网自噬定义、内质网自噬调控机制进行综述,并推测内质网自噬可能成为ARDS治疗新靶点。

中医药调控线粒体自噬防治慢性肾脏病的研究进展

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患病率逐年上升,已经成为高度流行的疾病,严重影响患者的生活质量,并造成家庭负担。引起慢性肾脏病的疾病很多,主要包括各种原发的以及继发的肾小球肾炎、肾小管损伤和肾血管的病变等。常规内科治疗虽在一定程度上可以缓解临床症状,但有时仍难阻止CKD的进展。中医药治疗CKD具有安全性较高,不良反应较少的特点,且临床疗效肯定,其活性成分可以通过多途径、多靶点发挥协同作用,延缓疾病进展,但其作用机制尚未完全阐明。通过回顾和研究该领域的国内外文献发现,线粒体自噬异常是不同形式肾脏疾病发病机制的共同特征。近年来,已有大量实验研究证明通过PINK1/Parkin信号通路和线粒体自噬受体途径调控线粒体自噬可延缓CKD的进展,保护肾功能。因此中医药通过相关途径调控线粒体自噬防治CKD成为近年来非常有潜力的治疗靶点。该文收集中医药通过相关途径调控线粒体自噬在防治CKD方面具有明确疗效的文献,以期为防治CKD,延缓其进入终末期肾脏病提供新靶点和新策略。

pCMV6-Entryp-Entry p62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立

【目的】构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系。【方法】以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证;将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量PCR和Western blotting进行验证。【结果】酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62 mRNA的表达显著升高;Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62 kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带。在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高。【结论】成功构建了pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系。

p62/SQSTM1和DAPK-1在子痫前期的作用研究进展

子痫前期(preeclampsia PE)是一种妊娠特异性疾病,发病机制及病因均不清楚,目前认为炎症和氧化应激是胎盘自噬改变的潜在刺激因素,会引起胎盘功能障碍和妊娠病理。自噬受体蛋白(sequestosome1 p62/SQSTM1)和死亡相关蛋白激酶1(deathassociatedproteinkinase-1,DAPK-1)均属于自噬调节因子,P62/SQSTM1和DAPK-1在子痫前期以自噬的形式发挥着特殊的影响,对生殖功能具有重要的调控作用。因此,本文从自噬角度探讨P62/SQSTM1和DAPK-1在子痫前期的作用研究进展。