自噬基因Beclin-1在前列腺癌组织中的表达及意义

目的探讨自噬基因Beclin-1在前列腺癌组织中的表达及其相关临床意义,并分析其与根治性前列腺切除术后生化复发的相关性。方法采用免疫组化Super Vision两步法检测132例前列腺癌组织及癌旁组织中Beclin-1的表达,并分析其与相关临床因素的关系。结果在前列腺癌组织及癌旁组织中Beclin-1的表达率分别为38.6%及54.5%,差异有统计学意义(P=0.01)。Beclin-1在Gleason评分中表现为评分越高,阳性表达率越低(P=0.011)。前列腺癌组织中Beclin-1的表达与不同年龄(P=0.138)、家族史(P=0.686)及是否患者前列腺炎病史(P=0.895)等临床因素比较,差异无统计学意义。但在有无淋巴结转移(P=0.017)、有无骨转移(P=0.002)及行根治性前列腺切除术后有无生化复发(P=0.024)间差异均有统计学意义。结论自噬基因Beclin-1在前列腺癌组织中表达下调,并与淋巴结转移、骨转移及生化复发有关,其表达下调可能参与前列腺癌的发生、发展。

自噬基因Beclin-1在急性淋巴细胞白血病中的表达及其意义

目的观察自噬基因Beclin-1在急性淋巴细胞白血病中的表达及其意义。方法选取2008年3月—2011年3月我院收治的急性淋巴细胞白血病76例作为试验组,同时选取健康人76例作为对照组,采用免疫组化技术检测两组外周血中有核细胞中Beclin-1的阳性表达率,并比较试验组中男性与女性及急性淋巴细胞白血病L1型与L2型Beclin-1阳性表达率的差异。结果试验组Beclin-1阳性表达率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。试验组中男性与女性及急性淋巴细胞白血病L1型与L2型Beclin-1阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在急性淋巴细胞白血病患者外周血的有核细胞中自噬基因Beclin-1的阳性表达率要低于正常健康人群。

非酒精性脂肪肝自噬基因Beclin-1与核因子NF-κBp65表达研究

目的探讨自噬基因Beclin-1在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型的表达及对NAFLD发病机制的影响。方法(1)选取24只成年雄性SD大鼠随机分为两组:NAFLD模型组(高脂饲料饲养)12只,正常组12只(普通饲料饲养)。连续饲养12周后处死两组大鼠,采取心脏取血法,检测血清生化学指标ALT、AST、TG、CHOL及低密度脂蛋白(LDL-C)。(2)将大鼠肝脏组织取出,取少许行病理切片,采用HE染色,光镜下观察肝脏组织病理变化,进一步评估肝脏脂肪变性程度及造模是否成功;免疫组化染色,确定NF-κBp65表达。(3)应用Western blot方法检测NAFLD造模成功后的大鼠肝组织中自噬基因(Beclin-1)蛋白的表达水平。结果(1)成功建立了大鼠NAFLD模型,血生化指标ALT、AST、CHOL、TG及LDL-C水平与对照组同期相比均明显升高(P=0.0422,0.0336,0.0405,0.0411,0.0433)。(2)Western blot图像结果显示,与对照组比较,模型组肝组织Beclin-1蛋白表达明显升高(P=0.0411)。(3)正常组大鼠肝小叶结构清晰完整,肝索呈放射状分布于中央静脉周围;模型组大鼠肝细胞内可见脂滴,NF-κBp65阳性,评分为44.01±0.22;免疫组化结果显示,NF-κB集中沉积在汇管区肝细胞胞浆,低倍镜视野下平均占细胞总数55.1 5±1.01%。结论自噬基因Beclin-1与NF-κBp65在NAFLD模型肝组织中表达水平升高并可能促进NAFLD发生发展过程。

LPS诱导大脑皮质胶质细胞自噬基因Beclin-1蛋白表达的研究

目的:探讨脂多糖(lipppolys accride,LPS)刺激对大脑皮质胶质细胞自噬相关基因Beclin-1蛋白表达的影响。方法:体外分离新生小鼠大脑皮质混合胶质细胞,采用1 μg/ml LPS刺激24h后收集细胞与培养上清。Western blotting检测Beclin-1蛋白表达水平;CCK-8试剂盒检测细胞增殖率。结果:LPS刺激后,大脑皮质混合胶质细胞Beclin-1蛋白表达水平增高,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);细胞增殖率下降,与对照组比较差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论:LPS能激活神经胶质细胞自噬相关基因Beclin-1,这种变化参与调节了胶质细胞的存活情况。

自噬相关基因微管相关蛋白1A/1B轻链3B在结肠癌中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关基因微管相关蛋白1A/1B轻链3B(MAP1LC3B)在结肠癌中的表达及临床意义。方法:采用癌症基因组图谱(TCGA)数据库中提供的临床和RNA-seq数据,以预测MAP1LC3B水平与结肠癌的关系。再利用免疫组织化学染色(IHC)、Western印迹等技术对人群样本(结肠癌组织40例,癌旁组织20例)中MAP1LC3B表达情况进行检测,验证其表达情况与临床病理参数包括肝转移与否、淋巴结转移与否及组织分化等的关系。结果:MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达阳性率为72.5%,明显高于癌旁组织组,差异具有统计学意义(P=0.001);在MAP1LC3B阳性组中,21例(72.41%)合并肝转移(P=0.001),且患者的TNM分期多为Ⅴ期患者,占79.31%,与MAP1LC3B阴性组比较差异具有统计学意义(P=0.001),但MAP1LC3B的表达与结肠癌组织的分化程度(P=0.056)和淋巴结转移情况比较,差异无统计学意义(P=0.265)。与TCGA数据库等分析结果有所差异,但Kaplan-Meier生存分析表明,MAP1LC3B高表达与预后不良显著相关,差异有统计学意义(P<0.01),且MAP1LC3B表达水平与CD8+T细胞的功能最为密切。结论:自噬相关基因MAP1LC3B在结肠癌组织中异常表达,并参与介导了肿瘤的恶性生物学行为,影响患者预后。

针刺调控自噬蛋白Beclin-1对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区Caspase-9的影响

目的 探讨针刺调控细胞自噬对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠海马区细胞凋亡的影响及机制。方法 110只SD大鼠随机分为正常组22只、假手术组22只和造模组66只,造模组使用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,成功后随机均分为模型组、针刺组、药物组,每组各22只。针刺组捆绑并针刺“大椎”“百会”“人中”,药物组注射依达拉奉。Garcia神经功能评分评定大鼠神经功能,TTC染色观察脑梗死情况,透射电镜观察海马区自噬小体,TUNEL检测患侧脑组织细胞凋亡率,免疫组化检测海马区半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达,Western blot检测海马区苄氯素-1 (Beclin-1)、Caspase-9表达。结果 干预前后与正常组比较,假手术组各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。干预前,与假手术组比较,造模组神经功能评分下降(P<0.01)。针刺72 h后,与假手术组比较,模型组神经功能评分下降(P<0.01)、脑梗死面积比上升(P<0.01)、缺血侧脑组织细胞凋亡率、海马区Caspase-9、Caspase-3表达量增加(P<0.01)、Beclin-1表达量下降(P<0.05);与模型组比较,药物组、针刺组神经功能评分显著上升(P<0.01)、梗死面积比缩小(P<0.01)、患侧脑组织细胞凋亡率及海马区Caspase-9、Caspase-3下降(P<0.01)、Beclin-1表达量上升(P<0.05)。透射电镜下模型组细胞器肿胀,大多数线粒体变大,见少量溶酶体;针刺组、药物组神经细胞轻度水肿,线粒体轻度肿胀,可见初级溶酶体、自噬小体、自噬溶酶体存在。结论 针刺可调控大鼠自噬关键蛋白抑制CIRI后细胞凋亡,其机制可能与调整自噬影响Caspase-9表达相关。

自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在胸腔积液中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在良恶性胸腔积液中的表达,分析其临床意义。方法:通过液基薄层细胞学检查及免疫组化检查并结合患者临床资料纳入300例胸腔积液标本作为研究对象,分为group165例(漏出性胸腔积液组)、group2142例(非肿瘤炎性胸腔积液组)及group393例(非小细胞肺癌性胸腔积液组),通过RT-PCR方法及Western blot方法分别检测各组胸腔积液中mTOR、Beclin-1及LC3在基因及蛋白水平的表达。结果:在基因和蛋白表达水平,group1及group2相较于group3在Beclin-1和LC3的表达水平均升高,而mTOR的表达则显著减低,差异均有统计学意义;同时,group2较group1在Beclin-1和LC3表达中均降低,mTOR的表达则升高,差异均有统计学意义;此外在良、恶性胸腔积液相关性分析中发现,在蛋白水平Beclin-1相对表达值与LC3表达值呈正相关,而mTOR相对表达值与Beclin-1、LC3表达值呈负相关。结论:自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在不同性质胸腔积液中表达存在差异,可能与炎性及非小细胞肺癌引起的肿瘤性胸腔积液的发病机制有关,可为胸腔积液性质鉴定提供新的分子学依据。

美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达

背景:脊髓损伤有氧化应激、炎症、凋亡、自噬等机制参与其中,激活自噬可改善脊髓损伤后的神经运动功能,对脊髓起保护作用。目的:探讨美洲大蠊研粉对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能和损伤区域自噬蛋白Beclin-1的影响。方法:取30只6-8周龄SD大鼠,采用随机数字表法分为3组,每组10只:假手术组仅打开椎板,暴露脊髓后缝合;生理盐水组与美洲大蠊组均建立左侧脊髓半横断损伤模型,术后第1天开始分别灌胃给予生理盐水与美洲大蠊研粉,连续给药14 d。术后6 h及1,3,7,14 d行BBB评分,观察后肢运动功能的情况;给药14 d后处死大鼠,采用免疫组化染色、Western Blot检测、免疫荧光染色检测脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达情况。结果与结论:①随着术后时间的延长,生理盐水组、美洲大蠊组大鼠BBB评分逐渐升高;与假手术组比较,生理盐水组、美洲大蠊组术后6 h及1,3,7,14 d的BBB评分均降低(P<0.05);美洲大蠊组术后7,14 d的BBB评分高于生理盐水组(P<0.05);②免疫组化染色显示,假手术组Beclin-1呈弱阳性表达,主要位于胞浆;生理盐水组Beclin-1主要位于胞浆,可见部分核膜表达;美洲大蠊组Beclin-1主要位于胞浆,可见部分核膜表达;生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于假手术组(P<0.05),美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于生理盐水组(P<0.05);③Western Blot检测与免疫荧光染色显示,生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于假手术组(P<0.05),美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于生理盐水组(P<0.05);④结果表明,美洲大蠊研粉能够改善脊髓半横断损伤大鼠的后肢运动功能,机制可能是美洲大蠊研粉中的多糖类物质增加了自噬蛋白Beclin-1的表达。

中药调控Beclin-1基因干预自噬治疗类风湿性关节炎的研究进展

类风湿性关节炎是一种难以治愈的自身免疫性疾病,其病因复杂,基本的病理表现为软骨的破坏、血管翳的生成等。有效治疗和预防类风湿性关节炎的发生及提高患者的生活质量是亟待解决的问题。现阶段临床治疗方法存在着用药量大,毒副作用强等弊端,近年来,以精准调控为优势并基于Beclin-1为代表的基因调节自噬和线粒体从而治疗类风湿性关节炎的研究不断发展,目前受到国内外专家学者的关注,具有广阔的发展前景。本文系统阐述在治疗类风湿性关节炎中Beclin-1、自噬和线粒体的相关联性,并发现中药在调节Beclin-1、自噬和线粒体治疗类风湿性关节炎的巨大潜力,因此对中药调控Beclin-1干预自噬治疗类风湿性关节炎进行系统性综述,并为该领域提供一定的科学参考。

自噬蛋白Beclin-1与N-myc下游调控基因2在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的探索自噬蛋白Beclin-1和N-myc下游调控基因2(NDRG2)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达,并探讨两种蛋白作为ESCC预后分子标志物的临床价值。方法采用免疫组织化学染色检测Beclin-1与NDRG2在121例ESCC组织中的表达,通过Pearson相关分析两者表达与临床病理参数的关系。根据Beclin-1与NDRG2的表达情况将所有患者分为2组,高、低表达组的生存概率通过Kaplan-Meier曲线计算,Log-rank检验用于生存分析的比较。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析,确定ESCC患者的独立预后因子。结果免疫组织化学染色分析显示Beclin-1蛋白在121例ESCC及癌旁组织中的阳性表达率分别为40.5%(49/121)和59.5%(68/121),差异有统计学意义(χ^(2)=5.973,P=0.015)。NDRG2蛋白在ESCC组织中的阳性表达率亦明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(46.3%vs.61.2%;χ^(2)=5.385,P=0.020)。Beclin-1低表达者有更为频繁的淋巴结转移(χ^(2)=6.158,P=0.013)和更晚的TNM分期(χ^(2)=4.538,P=0.033),而NDRG2低表达与更晚的T分期(χ^(2)=6.607,P=0.010)和TNM分期(χ^(2)=5.744,P=0.017)相关。Kaplan-Meier曲线显示,Beclin-1低表达与高表达患者的3年总体生存(OS)率分别为44.3%和60.9%,差异有统计学意义(χ^(2)=5.696,P=0.017)。NDRG2低表达者的预后亦明显低于NDRG2高表达者,3年OS率分别为43.9%和59.2%(χ^(2)=9.004,P=0.003)。单、多因素Cox比例风险模型分析表明,Beclin-1低表达(HR=1.727,95%CI:1.017~2.934,P=0.043)、NDRG2低表达(HR=1.671,95%CI:1.023~2.730,P=0.040)与TNMⅡ~Ⅲ期(HR=3.823,95%CI:2.133~6.852,P<0.001)是ESCC患者预后不良的独立预测因素。结论Beclin-1和NDRG2表达在ESCC中明显下调,且与患者不良预后相关,其可能是预测ESCC患者生存的预后标志物。

侵袭性垂体腺瘤中自噬相关基因Beclin-1和MAPLC3的表达

目的检测自噬相关基因Beclin-1和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein3,MAPLC3)在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达情况,探讨其与侵袭性垂体腺瘤侵袭性的关系。方法 61例垂体腺瘤手术标本按侵袭性垂体腺瘤综合判定方法分为侵袭组和非侵袭组,采用免疫荧光检测Beclin-1和MAPLC3蛋白的表达,RT-PCR法检测Beclin-1和MAPLC3mRNA的表达,分析侵袭组和非侵袭组Beclin-1和MAP1LC3表达水平的差异。结果 61例垂体瘤患者中,32例为侵袭性垂体腺瘤,29例为非侵袭性垂体腺瘤。侵袭性垂体腺瘤组Beclin-1的蛋白和mRNA表达均低于非侵袭性腺瘤组(P<0.05),MAPLC3的蛋白和mRNA表达也均低于非侵袭性腺瘤组(P<0.05),差别具有统计学意义。结论自噬相关基因Beclin-1和MAPLC3在侵袭性垂体腺瘤中的表达下调,提示其可能与侵袭性垂体腺瘤的侵袭性有关。

加味丹参饮预处理调控自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达抗大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的探讨加味丹参饮预处理是否通过调节Beclin-1和Atg5表达调控自噬抗缺血再灌注损伤大鼠心肌。方法将60只健康SD大鼠随机分为空白对照(control group,C)组、假手术(sham,S)组、缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)组、IRI+加味丹参饮(Jiawei Danshen Yin,JDY)组、IRI+JDY+自噬抑制剂(inhibitor,I)组,每组12只。通过结扎-放松大鼠左冠状动脉前降支制备心肌IRI模型。通过氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察心肌梗死面积率;在透射电镜下观察自噬泡;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测心肌Beclin-1和Atg5 m RNA表达;采用蛋白质印迹(western blot)法检测心肌Beclin-1蛋白表达变化。结果 IRI+JDY组心肌梗死面积率显著低于IRI组及IRI+JDY+I组(P<0.01)。电镜结果显示,IRI+JDY组适度调节大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的自噬,改善心肌细胞结构。IRI组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较SG组显著升高(P<0.01);IRI+JDY组、IRI+JDY+I组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI组显著降低(P<0.01);IRI+JDY组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI+JDY+I组显著升高(P<0.01)。结论加味丹参饮通过调节缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达适度,调控缺血再灌注心肌细胞发生适度自噬,从而发挥细胞保护作用。

自噬基因Beclin-1通过食管癌相关基因4通路影响A549肺癌细胞自噬和凋亡

目的探讨自噬基因Beclin-1表达沉默对A549肺癌细胞自噬和凋亡的影响以及其作用机制。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）和Westernblot的方法分别检测转染后各组A549肺癌细胞Beclin-1mRNA和蛋白的表达；噻唑蓝（MTT）法检测各组A549细胞生长增殖；单丹磺酰戊二胺（MDC）法检测各组A549细胞自噬的变化；用流式细胞仪检测各组A549细胞凋亡；Westernblot方法检测各组A549细胞食管癌相关基因4（ECRG4）蛋白表达变化。结果与对照组比较，感染Beclin-1小干扰RNA（siaNa）慢病毒颗粒后，A549细胞中Beclin-1mRNA和蛋白表达显著减少（P〈0．05），Beclin-1mRNA的沉默效率分别为35．56％、89．22％和66．78％；感染Beclin-1siRNA慢病毒颗粒后，A549细胞凋亡率为（4．31±0．49）％，和对照组比较显著降低（P〈0．05）；感染Beclin-1siRNA慢病毒颗粒后，A549细胞群体平均倍增时间为（37．7±2．6）h，和对照组比较，平均倍增时间缩短（P〉0．05）；感染Beclin—1siRNA慢病毒颗粒后，和对照组比较，A549细胞自噬细胞阳性数量减少（P〉0．05）；感染Beclin-1siRNA慢病毒颗粒后，和对照组比较，ECRG4蛋白表达下降（P〈0．05）。结论自噬基因Beclin-1通过ECRG4通路影响A549肺癌细胞自噬和凋亡。

自噬基因Beclin-1通过食管癌相关基因4通路抑制A549肺癌细胞增殖

目的 探讨自噬基因Beclin-1过表达对A549肺癌细胞自噬和增殖的影响以及其作用机制.方法 用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot的方法分别检测转染后各组A549肺癌细胞Beclin-1 mRNA和蛋白的表达;噻唑蓝（MTT）法检测各组A549细胞生长增殖;单丹磺酰戊二胺（MDC）法检测各组A549细胞自噬的变化;Western blot方法检测各组A549细胞食管癌相关基因4（ECRG4）蛋白表达变化.结果 与对照组比较,感染pLenex-Beclin-1慢病毒颗粒后,A549细胞中Beclin-1 mRNA和蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与对照组比较,感染pLenex-Beclin-1慢病毒颗粒后,Beclin-1过表达组细胞群体平均倍增时间[（46.0＆#177;2.4）h]显著延长（P＜0.05）;与对照组比较,感染pLenex-Beclin-1慢病毒颗粒后,自噬细胞阳性数量[（10.0＆#177;1.5）个]显著增加（P＜0.05）;与对照组比较,感染pLenex-Beclin-1慢病毒颗粒后,ECRG4蛋白表达增加（P＜0.05）.结论 自噬基因Beclin-1通过ECRG4通路抑制A549肺癌细胞增殖.

自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3表达与口腔癌生物学特征的关系

目的:研究自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3表达与口腔癌生物学特征的关系。方法:取口腔癌组织和癌旁组织,检测Beclin-1和MAP1LC3的mRNA表达量;培养舌癌细胞株CTST-2和正常颊粘膜的原代上皮细胞,检测自噬标志分子(Beclin-1、MAP1LC3)以及促凋亡基因(P53、Caspase-3)、抗凋亡基因(生存素、Bcl-2、Bmi-1)的mRNA表达量。结果:舌癌、颊粘膜癌、牙龈癌、口底癌组织中Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量显著低于相应的癌旁组织;舌癌细胞CTST-2中Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量均低于正常粘膜细胞;舌癌细胞CTST-2中P53、Caspase-3的mRNA含量均低于正常粘膜细胞,与Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量呈正相关;CTST-2中生存素、Bcl-2、Bmi-1的mRNA含量均高于正常粘膜细胞,与Beclin-1、MAP1LC3的mRNA含量呈负相关。结论:口腔癌中自噬相关基因Beclin-1和MAP1LC3的表达量异常降低且与癌细胞的促凋亡基因、抗凋亡基因的表达具有显著相关性。

自噬相关基因Beclin-1在间歇期痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达变化及意义

目的探讨自噬相关基因Beclin-1在间歇期痛风性关节炎(IGA)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达变化及意义。方法采集40例间歇期IGA男性患者(IGA组)、80例体检健康男性(正常对照组)外周静脉血,分离PBMC并进行培养。用实时荧光定量PCR、Western blotting技术分别检测PBMC中Beclin-1 mRNA、蛋白表达。随机抽取5例IGA患者外周静脉血20 m L,分为未刺激组及尿酸盐晶体(MSU)刺激1、3、6 h组并提取其PBMC,用Western blotting技术检测PBMC中Beclin-1蛋白表达。随机抽取5例IGA患者、5例体检健康者外周静脉血20 m L,将血液标本均随机分为空白对照组、雷帕霉素组、自噬抑制剂组。空白对照组不做干预,其他各组均加入相应试剂进行干预并提取PBMC,用Western blotting技术检测PBMC中Beclin-1蛋白表达;用酶联免疫吸附试验测定干预后IGA患者血浆IL-1β水平。结果与正常对照组比较,IGA组PBMC中Beclin-1 mRNA、蛋白相对表达量低(P均<0. 05)。MSU刺激1、3 h组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量较未刺激组高(P均<0. 05),而MSU刺激6 h组Beclin-1蛋白相对表达量较未刺激组低(P <0. 05)。IGA患者PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量比较:雷帕霉素组较空白对照组低(P <0. 01),且自噬抑制剂组最高(P均<0. 05),恢复至空白对照组水平;体检健康者PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量比较:空白对照组、MSU组、雷帕霉素组比较差异无统计学意义(P均> 0. 05),而自噬抑制剂组较其他组低(P均<0. 05)。IGA患者血浆IL-1β水平比较,MSU、雷帕霉素组较空白对照组高(P均<0. 05),雷帕霉素组较MSU组低(P <0. 05),自噬抑制剂组较空白对照组、MSU组高(P均<0. 05),自噬抑制剂组之间比较差异无统计学意义(P均> 0. 05)。结论自噬相关基因Beclin-1在间歇期IGA患者外周血PBMC中呈低表达,其可能在IGA发展过程中参与自噬途径并最终被自噬溶酶体降解。

基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究

目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明,成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×10^(8) TU·mL^(-1),建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75%(P<0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力。以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。

基于加权基因共表达网络鉴定肾移植术后排斥反应中巨噬细胞M1亚型相关基因

目的鉴定肾移植术后排斥反应中巨噬细胞M1亚型表达的相关基因并构建风险模型预测移植肾存活。方法在基因表达综合(GEO)数据库下载肾移植术后的GSE36059及GSE21374数据集。GSE36059包括发生排斥反应和稳定移植物的样本,使用该数据集进行加权基因共表达网络分析(WGCNA)和差异分析筛选差异表达的巨噬细胞M1亚型相关差异表达基因(M1-DEG)。随后将GSE21374数据集(包含了移植物丢失的随访数据)按照7∶3拆分为训练集以及验证集,在训练集中使用最小绝对收缩和选择算法(LASSO)筛选变量构建多因素Cox模型,并评估模型预测移植物存活的能力。使用CIBERSORT分析高、低风险组浸润的免疫细胞的差异,并分析两组间人类白细胞抗原(HLA)相关基因的分布,基因集富集分析(GSEA)用于进一步明确高风险组中富集的生物学过程以及通路。最后使用数据库预测与预后基因互作的微小核糖核酸(miRNA)。结果在GSE36059数据集中,筛选得到14个M1-DEG。在GSE21374数据集中,使用LASSO-Cox回归筛选出Toll样受体8(TLR8)、Fcγ受体1B(FCGR1B)、BCL2相关蛋白A1(BCL2A1)、组织蛋白酶S(CTSS)、鸟苷酸结合蛋白2(GBP2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶招募域家族成员16(CARD16),基于这6个M1-DEG构建多因素Cox模型。风险模型在训练集中预测1年及3年移植物存活的受试者工作特征曲线下面积(AUC)分别为0.918和0.877,在验证集中预测1年及3年移植物存活的AUC分别为0.765及0.736。免疫浸润分析表明,高风险组静息及活化的CD4+记忆T细胞、γδT细胞、巨噬细胞M1亚型浸润增多(均为P<0.05)。高风险组HLAⅠ类基因表达上调。GSEA分析表明,高风险组免疫反应及移植物排斥反应富集。CTSS与8个miRNA相互作用、BCL2A1和GBP2与3个miRNA相互作用、FCGR1B与1个miRNA相互作用。结论本研究基于6个M1-DEG构建的预后风险模型对于预测移植肾存活具有良好的表现,可为早期对高风险受者干预提供依据。

Beclin-1联合Cx43对甲状腺癌的诊断价值及与甲状腺细针穿刺诊断准确率对比

目的 探讨自噬相关基因Beclin-1联合细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)对甲状腺癌的诊断价值,并分析两者联合与甲状腺细针穿刺诊断对甲状腺癌准确率差异。方法 选取医院2020年10月至2023年10月收治的80例甲状腺癌患者作为观察组,另取同期收治的80例甲状腺结节患者作为对照组,取所有患者术后病理组织进行免疫组化染色,qRT-PCR仪进行检测与扩增,采用2-△△α法计算Beclin-1、Cx43的相对表达量,并将两组患者Beclin-1、Cx43水平进行对比。采用Spearman相关分析法分析Beclin-1、Cx43和甲状腺癌的相关性,并使用受试者工作特征(ROC)曲线分析Beclin-1联合Cx43诊断甲状腺癌的效果,并对比两者联合与甲状腺细针穿刺对甲状腺癌的诊断价值。结果 经免疫组化结果显示,两组细胞质内均检测到Beclin-1、Cx43,且观察组的Beclin-1、Cx43相对表达量比对照组更少(P<0.05),而Beclin-1、Cx43阳性率也同样小于对照组(P<0.05);Spearman相关分析结果显示,Beclin-1、Cx43和甲状腺癌呈现负相关(P<0.05);Beclin-1对甲状腺癌的诊断曲线下面积为0.822,最佳阈值为13.52;Cx43诊断甲状腺癌的曲线下面积为0.875,最佳阈值为18.67,两者联合的曲线下面积为0.932;Beclin-1联合Cx43对甲状腺癌的诊断灵敏度与特异度明显高于单一指标(P<0.05);Beclin-1联合Cx43对甲状腺癌的诊断准确率为93.75%,甲状腺细针穿刺对甲状腺癌的诊断准确率为98.75%,两者对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论Beclin-1联合Cx43对甲状腺癌的诊断灵敏度与特异度较高,且两者联合与甲状腺细针穿刺诊断甲状腺癌准确率对比并无显著差异,可考虑将Beclin-1、Cx43两者作为甲状腺癌诊断及预后判断的重要标志物。