小麦自噬相关因子ATG5的原核表达和抗血清制备

细胞自噬在植物生长发育和环境响应中扮演了重要角色,ATG5是参与自噬小体组装的核心因子之一。在前期工作中我们克隆了两个小麦ATG5基因TaATG5a和TaATG5b,并对其开展了初步的功能分析。鉴于后续基因功能研究中的免疫学方法涉及对特异性抗体的需求,通过载体构建、原核表达和亲和层析过程获得了TaATG5a的重组蛋白,经兔免疫过程制备了TaATG5a的抗血清,采用ELISA和Western杂交等方法鉴定了抗体的效价和特异性。结果表明,克隆于pET30a载体上的TaATG5a在大肠杆菌中能够被IPTG高效诱导表达,重组蛋白的表观分子量与理论值基本一致,表达量在诱导0-8h范围内逐渐增加。纯化的重组蛋白纯度较高,满足抗体制备要求。制备的抗血清能特异性识别原核表达和小麦内源的TaATG5a,效价达到1∶25600。此外,制备的抗血清通过Western杂交还能够识别共价连接的小麦ATG12-ATG5复合物,该复合物是小麦叶片中ATG5的主要存在形式。

西格列汀对2型糖尿病小鼠胰岛β细胞自噬相关因子表达的影响

目的观察西格列汀对2型糖尿病小鼠胰岛β细胞自噬相关因子Atg3、Atg12与Beclin1表达的影响,探讨其治疗机制。方法将30只9周龄雄性db/db小鼠随机平均分为2组,DT组灌胃给予西格列汀(80 mg/kg),DC组给予等量饮用水,每日给药1次,治疗5周。测定血糖、血清胰岛素与组织胰岛素水平;免疫荧光技术观察胰岛形态结构;实时荧光定量PCR法分析胰岛β细胞Atg3、Atg12与Beclin1 mRNA的表达;免疫组织化学方法测定胰岛β细胞Beclin1蛋白表达;并盒分析胰岛β细胞Caspase3活性改变。结果西格列汀治疗5周后,与DC组比较,DT组小鼠血糖降低(P<0.01),血清胰岛素及组织胰岛素水平增加(P均<0.01)。DC组小鼠胰岛α细胞散布于胰岛中,所占比例大;DT组小鼠胰岛β细胞居于胰岛中央部,所占比例大。与DC组相比,DT组小鼠胰岛β细胞Caspase 3活性及Atg12、Atg3、Beclin1 mRNA相对表达降低(P均<0.01),Beclin1蛋白表达减少(P<0.01)。结论西格列汀通过下调2型糖尿病小鼠胰岛β细胞自噬相关因子Atg12、Atg3与Beclin1的表达,抑制胰岛β细胞凋亡,改善胰岛的结构与β细胞功能。

GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子的影响

目的探讨GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子的影响。方法将纳入的40只小鼠分为正常组、对照组、空载组及治疗组,每组各10只。正常组正常饲养,对照组、空载组及治疗组使用链脲佐菌素(STZ)造模;对照组及正常组采用生理盐水干预,空载组采用空载体重组减毒沙门菌干预,治疗组采用GLP-1重组减毒沙门菌干预;在造模前、造模成功后及治疗结束后进行眼眶取血,使用血糖仪检测血中血糖水平,治疗结束后检测小鼠Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子表达情况。结果治疗组小鼠血糖水平治疗后显著低于对照组及空载组(P<0.05);治疗组小鼠胰岛Caveolin-1水平治疗后显著高于对照组及空载组(P<0.05),对照组及空载组Caveolin-1水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后治疗组小鼠胰岛Atg3、Atg12及Beclin1水平显著低于对照组及空载组(P<0.05),对照组及空载组Atg3、Atg12及Beclin1水平较治疗前无明显差异(P>0.05)。结论采用GLP-1重组减毒沙门菌治疗后可有效改善2型糖尿病小鼠Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子表达,有较广的应用价值。

电针对CSR大鼠神经细胞自噬相关因子Beclin1 mRNA、LC3 mRNA表达的影响

目的通过观察电针颈夹脊穴对神经根型颈椎病(CSR)大鼠神经细胞自噬相关蛋白Beclin1 mRNA、LC3 mRNA表达的影响,探讨其对CSR大鼠镇痛过程中对自噬调控的作用机制。方法 SPF级SD大鼠按随机数字表分为模型组、针刺组、电针组,每组各10只。采用手术方法将尼龙渔线放至大鼠C6-7、T1神经根腋下复制CSR模型。造模后第3天开始取双侧C2-3、C6-7节段颈夹脊穴进行,电针组进行电针治疗,针刺组进行针刺治疗,每天1次,每次20min;模型组造模后第3天开始每天抓取1次;各组大鼠连续干预7天后处死。治疗后采用YLS-3E型痛分析仪测量机械性痛阈,WB法检测自噬底物P62蛋白的表达,RT-PCR法检测脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3 mRNA的表达。结果与模型组比较,电针组及针刺组各大鼠的痛阈值较模型组明显升高(P<0.01);电针组与针刺组比较,电针组各大鼠的痛阈值较针刺组明显升高(P<0.05);与模型组比较,电针组及针刺组的脊髓及神经组织P62的蛋白含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组及针刺组的脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3的mRNA含量显著升高(P<0.01)。电针组与针刺组相比,脊髓及神经组织Beclin1 mRNA、LC3 mRNA含量显著性升高(P<0.05)。结论电针及针刺颈夹脊穴对CSR大鼠均具有显著镇痛作用,可通过调节大鼠脊髓及神经组织神经细胞的自噬保护神经细胞,且电针颈夹脊穴疗效优于针刺颈夹脊穴,其作用机制可能与上调Beclin1 mRNA、LC3 mRNA有关。

自噬与骨肉瘤研究进展

骨肉瘤是一种骨髓间充质来源的原发性恶性骨肿瘤,通常发生在长骨干骺端和膝关节周围,主要发生在青少年时期,成人呈现双峰年龄分布。通常采取多种方式联合治疗,包括辅助化疗、截肢与保肢重建手术。化疗联合手术治疗能够极大提高生存率,然而超过80%的手术治疗患者表现出转移,患者预后极差。此外,化疗所带来的毒性和副作用严重影响了患者的治疗效果。当前自噬上调被发现存在于多种肿瘤疾病中,降低自噬可限制肿瘤生长。

细胞自噬在骨肉瘤中的作用机制

背景:自噬似乎在癌症形成的早期阶段充当肿瘤抑制因子,然而在后期阶段,自噬可能支持或促进肿瘤生长、扩散,并可能增加治疗耐药性。目的:综述国内外相关文献,总结自噬与骨肉瘤的关系,探讨细胞自噬在骨肉瘤中的作用机制及治疗前景。方法:中文以“自噬,化学治疗,自噬相关因子,骨肉瘤,细胞凋亡,耐药”检索CNKI、万方、维普数据库;英文以“Autophagy,Chemotherapy,Autophagy related factors,Osteosarcoma,Apoptosis,Drug resistance”检索PubMed数据库,收录与自噬在骨肿瘤中的作用机制相关的文献报道,按照选文标准对文献进行筛选,并排除重复性研究及年代久远的文献。共纳入52篇文章进行综述分析。结果与结论:①自噬可能是促进和预防癌症的重要因素,其作用随着肿瘤发生发展而表现出不同;②对自噬途径的充分了解和调节可能提高肿瘤治疗的潜力;③考虑到自噬在肿瘤生物学中的重要性,研究自噬调节miRNA将有助于更好地了解恶性肿瘤,并可能会发现新的疾病标志物和治疗策略;④上述结论仍需要大量更科学的研究及合理的实验予以证实。

健脾祛湿和络方含药血清对足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及mTOR表达的影响

目的探讨健脾祛湿和络方(Jianpi Qushi Heluo Formula,JQHF)含药血清对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的小鼠足细胞损伤模型标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及mTOR相关自噬因子表达的影响。方法以体外培养小鼠足细胞为研究对象,除空白组外均以PAN(100μ/mL)体外诱导足细胞,根据含药血清细胞培养基的不同分为空白组(10%空白血清),模型组(10%空白血清+PAN),JQHF低剂量组(10%低剂量JQHF含药血清+PAN),JQHF中剂量组(10%中剂量JQHF含药血清+PAN),JQHF高剂量组(10%高剂量JQHF含药血清+PAN),替米沙坦(TMST)组(10%TMST含药血清+PAN),醋酸泼尼松(PRE)组(10%PRE含药血清+PAN),雷帕霉素(RAP)组(100μg/L RAP+10%空白组血清+PAN)。CCK-8法检测足细胞损伤模型在各组血清作用后的活性变化;Western blot法检测各组足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及细胞内mTOR相关自噬蛋白表达水平。结果 (1)与空白组比较,模型组细胞活力显著下降(P<0.01),与模型组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组足细胞活力上升(P<0.05);(2)与模型组比较,除JQHF低剂量组Podocalyxin表达外,其余各药物干预组Nephrin、Podocalyxin表达均增多(P<0.05,P<0.01);与JQHF低剂量组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组Nephrin表达增多(P<0.05);与JQHF中剂量组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组Nephrin表达增多(P<0.05),TMST、PRE、RAP组Podocalyxin表达亦增多(P<0.05);与JQHF高剂量组比较,TMST、PRE、RAP组Podocalyxin表达增多(P<0.05)。(3)与模型组比较,各药物干预组LC3-Ⅱ表达均增多(P<0.05,P<0.01),JQHF高剂量组、TMST组、PRE组、RAP组P-mTOR、P-4EBP1表达均减少(P<0.05),JQHF高剂量组、TMST组、RAP组P-P70S6K表达减少(P<0.01)。结论 JQHF可以改善细胞内自噬水平,修复PAN诱导损伤足细胞,与上调细胞内Nephrin、Podocalyxin及LC3-Ⅱ的表达,减少mTOR及相关因子合成有关。