自噬相关基因Atg12和LC3-Ⅱ在脑缺血再灌注大脑表达的实验研究

目的:探讨局灶性脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)时大脑皮质自噬相关蛋白-12(autophagy related protein-12,Atg12)和自噬微管相关蛋白轻链3抗体Ⅱ(autophagy microtubule-associated protein light chain 3 antibodyⅡ,LC3-Ⅱ)的激活规律,在此基础上探讨其对脑组织自噬的影响。方法:实验分为假手术组(sham组)和缺血再灌注组(CIR组),且CIR组下设CIR 0、6、12、24、48、72h共6个亚组。除sham组和CIR 24h组为每组20只外(其中10只用于模型鉴定),其余为每组10只。采用大脑中动脉栓塞术制备局灶性脑缺血再灌注模型,再灌注24 h后采用神经功能评分、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色、脑组织含水量来鉴定脑缺血模型是否成功。采用免疫组化和免疫印迹方法检测大脑皮质Atg12和LC3-Ⅱ的表达规律。结果:与sham组比较,CIR 24h组可见明显的神经功能缺损、脑梗死和明显的脑水肿。免疫组化结果显示,Atg12和LC3-Ⅱ在大鼠脑缺血再灌注6 h开始表达[阳性率分别为(15.49±4.18)%、(18.54±3.62)%],在24~48 h达高峰[(33.63±3.26)%、(29.62±1.73)%],72 h之后逐渐减弱[(24.90±3.96)%、(20.36±3.51)%]。免疫印迹结果显示,Atg12和LC3-Ⅱ在大鼠脑缺血再灌注6 h开始表达[表达量为(0.372 3±0.076 5)、(0.148 4±0.011 5)],在24~48 h达高峰[(0.741 7±0.071 8)、(0.451 3±0.019 0)],72 h之后逐渐减弱[(0.365 0±0.042 0)、(0.245 1±0.030 3)]。结论:脑缺血时Atg12和LC3-Ⅱ在调节脑缺血的脑组织自噬方式中具有重要的作用。

人黑色素瘤相关抗原基因-12基因疫苗对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及体内抗体水平的影响

目的:研究人黑色素瘤相关抗原基因-12(MAGE-12)基因疫苗pEGFP-C3-MAGE-12对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及体内抗体水平的影响。方法:小鼠80只,随机分为4组,每组20只。疫苗组、空质粒组和生理盐水(NS)组接种Lewis肺癌瘤组织制备Lewis肺癌小鼠模型。接种癌组织前14d、7d、0d,疫苗组按每次每只0.2mL(75ng/L)于右下肢内侧肌肉群内注射pEGFP-C3-MAGE-12;空质粒组和NS组每只每次注入pEGFP-C3空质粒或NS;空白对照组小鼠不做任何处理。每3d观察并记录1次肿瘤大小。接种瘤组织后14d每组取10只小鼠,ELISA法检测血清MAGE-12-Ab,余小鼠(每组10只)自然死亡,记录生存时间。结果:3组7d成瘤率均为100%。空质粒组、NS组及疫苗组生存期分别为(27.0±0.3)d,(27.2±0.3)d和(28.9±0.6)d;肿瘤体积分别为(179.775±9.085)mm3,(173.172±9.085)mm3和(144.923±9.528)mm3;疫苗组血清MAGE-12-Ab水平为(711.16±174.78),其他3组未检测到MAGE-12-Ab;与空质粒组、NS组比较,疫苗组生存期短(P<0.05),肿瘤体积小(P<0.05),体内抗体水平高(P<0.05)。结论:MAGE-12基因疫苗具有免疫治疗作用。

miR-23b通过调控ATG12抑制宫颈癌细胞自噬并逆转顺铂耐药性

目的探讨microRNA-23b(miR-23b)通过调控自噬相关基因-12(ATG12)的表达抑制宫颈癌细胞自噬并逆转顺铂耐药性的作用机制。方法采用顺铂长期浓度梯度递增法体外建立HeLa/DDP耐药细胞株,分别转染阴性空质粒(miR-NC组)和miR-23b mimics(miR-23b mimics组),另将未经处理的HeLa/DDP细胞作为空白对照组,将自噬诱导剂雷帕霉素干预细胞作为miR-23b mimics+雷帕霉素组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法和Western blotting法检测miR-23b和ATG12表达。双荧光素酶报告实验分析miR-23b的靶基因。采用MTT法和Annexin V/PI双染法检测各组细胞对顺铂的敏感性。另外采用电镜和共聚焦显微镜观察各组细胞自噬体的形成情况。结果历时6个月,成功建立HeLa/DDP细胞,其耐药指数为14.613±0.319。与HeLa细胞比较,HeLa/DDP细胞中miR-23b表达量下降(1.02±0.13 vs.0.45±0.08),而ATG12蛋白表达量升高(0.31±0.03 vs.0.90±0.08),差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,ATG12是miR-23b下游靶基因。与空白对照组和miR-NC组比较,miR-23b mimics组HeLa/DDP细胞中GFP-LC3绿色荧光的细胞质小点明显减少,且ATG12蛋白表达量降低(P<0.05);但是miR-23b mimics+雷帕霉素组细胞中出现大量GFP-LC3荧光小泡。经流式细胞术检测,miR-23b mimics组HeLa/DDP细胞凋亡率明显高于空白对照组和miR-NC组,而miR-23b mimics+雷帕霉素组细胞凋亡率则低于miR-23b mimics组(P<0.05)。结论miR-23b与宫颈癌细胞对顺铂获得性耐药有关,而ATG12是miR-23b抑制耐药细胞自噬的下游蛋白。

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的:研究重组鼠白细胞介素12(AdCMVIL-12)与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(AdCMVGM-CSF)的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法:将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组(联合治疗组)和AdCMVLacZ组(对照组),每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果:病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为(60.73±11.36)mm3,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组[分别为(675.18±80.59)、(186.91±19.15)和(223.45±23.11)mm3]比较差异均有显著性(P<0.01)。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为(69.53±9.20)%。结论:IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。

夹脊电针通过miR-128-3p/ATG12轴干预大鼠脊髓损伤后神经功能的机制研究

目的分析夹脊电针对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响,并探讨其可能机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针组以及夹脊电针+anta-miR-128-3p组,每组10只。假手术组与模型组不做处理,夹脊电针组给予电针干预(每日1次,每次20 min,连续2周),夹脊电针+anta-miR-128-3p组在末次电针刺激后,尾静脉注射anta-miR-128-3p。干预结束后通过行为学(Basso Beattie Bresnahan,BBB)评分评估大鼠运动功能;苏木素-伊红染色与原位末端标记法染色观察大鼠脊髓病理改变以及凋亡情况;免疫荧光法测定脊髓组织神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)阳性表达;qRT-PCR法检测脊髓组织miR-128-3p、自噬相关蛋白12(autophagy-related protein 12,ATG12)mRNA水平;Western blot法检测ATG12蛋白表达;双荧光素酶报告基因验证miR-128-3p与ATG12关系。结果假手术组脊髓结构完整,排列整齐;模型组大鼠脊髓结构紊乱,神经元数量减少,存在大量炎性浸润;夹脊电针组脊髓结构紊乱现象有所减轻,炎性浸润减少;与夹脊电针组比较,夹脊电针+anta-miR-128-3p组脊髓损伤加剧;与假手术组比较,模型组大鼠BBB评分、miR-128-3p水平、NeuN阳性神经元数量降低(P<0.05),凋亡率、ATG12 mRNA水平与ATG12蛋白表达升高(P<0.05);夹脊电针组大鼠BBB评分、miR-128-3p水平、NeuN阳性神经元数量高于模型组(P<0.05),凋亡率、ATG12 mRNA水平与ATG12蛋白表达低于模型组(P<0.05);与夹脊电针组比较,夹脊电针+anta-miR-128-3p组大鼠BBB评分、miR-128-3p水平、NeuN阳性神经元数量降低(P<0.05),凋亡率、ATG12 mRNA水平与ATG12蛋白表达升高(P<0.05);miR-128-3p与ATG12靶向结合。结论夹脊电针可能通过调控miR-128-3p/ATG12轴,改善脊髓损伤大鼠神经功能损伤。

原花青素对Aβ25-35诱导去血清培养PC12细胞细胞周期相关基因表达变化的影响

目的探讨原花青素（Proanthocyanidins，PAC）对β-淀粉样肽（25—35）[βamyloid peptide-（25—35），Aβ25-35]诱导体外去血清培养PC12细胞周期相关基因p21、CDK4、磷酸化pRb、E2F1表达异常的影响。方法种入培养瓶的PC12细胞贴壁后用常用的去血清培养法使细胞同步于C0期，分为0对照组、Aβ25-35诱导组、PAC保护组，按实验需要分别在不同时间加入药物并收集细胞，通过RT—PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测p21、cdk4、pRb、E2F1基因表达水平的变化。

人自噬相关基因12真核表达载体的构建及表达

目的:构建带myc标签的自噬相关基因12(ATG12)的真核表达载体,获得myc-ATG12融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG12编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体构建重组质粒,转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与ATG3表达质粒共转染293T细胞,免疫共沉淀法检测二者的相互作用。结果:myc-ATG12真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约17×103,可与Flag-ATG3结合。结论:构建并表达了带myc标签的人ATG12真核表达载体,为进一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基础。

白细胞介素-12B基因多态性与原因不明复发性流产的相关性分析

目的分析白细胞介素-12B(IL-12B)基因启动子区多态性与原因不明复发性流产(URSA)的相关性。方法 URSA患者83例(URSA组),同期门诊体检健康妇女90例(对照组),采用RT-PCR法检测两组IL-12B基因多态性。结果在IL-12B基因启动子区共发现2个单核苷酸多态性,即-671G/T和-405G/T,两组IL-12B基因-671G/T、-405G/T多态性分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。URSA组-671T/-405G单体型比例(0.65%)高于对照组(0.41%),P<0.05。结论 IL-12B基因启动子区单体型-671T/-405G基因型可能与URSA发生有关。

宫颈组织HPV E6/E7 mRNA Atg-12 Tie-1表达情况与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的探讨宫颈组织人类乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白-12(Atg-12)、酪氨酸激酶受体-1(Tie-1)表达情况与鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法选取2020年5月至2021年10月新乡市中心医院病理科诊断为SIL的患者227例,根据宫颈病变分级分为低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组124例和高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组103例,另选取子宫肌瘤手术患者80例为对照组。所有患者均采用支链DNA信号扩增法检测HPV E6/E7 mRNA,采用免疫组化法及免疫印迹法检测Atg-12、Tie-1蛋白。分析E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1与病理分级的相关性,绘制受试者特征(ROC)曲线分析各指标对HSIL与LSIL的鉴别诊断价值。结果HSIL组的HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白阳性检出率高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白阳性检出率低于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的HPV E6/E7 mRNA拷贝数、Tie-1蛋白表达量高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白表达量低于LSIL组和对照组(P<0.05)。HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白表达量与SIL病理分级呈正相关(r=0.514,0.488),Atg-12蛋白表达量与SIL病理分级呈负相关(r=-0.433)。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1鉴别诊断HSIL与LSIL的灵敏度为88.57%、74.29%、82.86%,特异度为57.14%、66.67%、64.29%。3项指标联合诊断的灵敏度为77.14%,特异度为85.71%(AUC=0.854)。结论HSIL患者HPV E6/E7 mRNA、Tie-1表达较高,Atg-12表达较低。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1表达与SIL病理分级有一定相关性,联合诊断可为HSIL与LSIL的鉴别诊断提供参考。

自噬相关基因LC3和ATG5在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相关基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)在胃癌细胞发生发展不同阶段的表达情况并分析其临床意义。方法选取胃黏膜正常细胞、胃黏膜不典型增生细胞、胃癌细胞共58例,分别记为正常组(17例)、不典型组(19例)、胃癌组(22例),采用qRT-PCR、Western Blot、免疫组织化学法检测每组中自噬相关基因LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达水平,应用SPSS 23.0软件分析正常组、不典型组、胃癌组3组间LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达情况,并分析LC3和ATG5蛋白表达的相关性以及LC3和ATG5蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数的关系。结果正常组、不典型组、胃癌组中LC3和ATG5 mRNA及蛋白表达水平逐渐升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。LC3蛋白表达情况与性别、年龄、浸润深度、分化程度及淋巴结状态均不存在相关性。ATG5蛋白表达情况与浸润深度、分化程度及淋巴结状态均有相关性。LC3和ATG5蛋白在3组中均呈正相关(P<0.05)。结论细胞自噬可促进胃癌的发生发展,其机制可能与LC3、ATG5过度表达有关。LC3、ATG5在促进胃癌的发生发展中起相互协同的作用。

PC12细胞在缺氧条件下的自噬现象

目的:考察PC12细胞内自噬发生与缺氧时间的关系,探讨自噬对缺氧细胞的影响作用。方法:以PC12细胞为模型,将对数生长期的细胞加入96孔培养板,37℃、5%CO_2培养24 h后,放入0.5%O_2、94.5%N_2和5%CO_2的培养箱缺氧1 h、3 h、6h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h,用MTT法检测细胞存活率,透射电镜观察细胞内自噬体,Westen blot法检测自噬相关蛋白(LC3B、Atg5和Beclin1)的表达,用试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧自由基(ROS)和线粒体膜电位(MNP)水平,探究缺氧不同时间自噬对PC12细胞的作用。结果:在缺氧3~12 h,PC12细胞自噬明显增加,自噬相关蛋白(LC3B、Atg5和Beclin1)表达增加,尤其是缺氧9 h,PC12细胞存活明显增加,表明短时间缺氧自噬对细胞起保护作用,而随着缺氧时间的延长细胞存活明显降低,自噬相关蛋白表达水平减少,细胞LHD和ROS水平明显增加。MMP水平显著下降,细胞凋亡明显增加。结论:在缺氧早期自噬对PC12细胞起保护作用,但缺氧时间较长,超过了细胞自身调节能力导致细胞死亡。

慢病毒介导shRNA沉默LAMP-2A和TSG101表达对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响

目的采用慢病毒介导的shRNA干扰技术,下调PC12细胞中溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP-2A)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene101,TSG101)的表达,并研究其对EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响。方法以LAMP-2A和TSG101为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切的p HBLV-U6-Puro载体连接获得重组慢病毒载体;将其与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,收集并浓缩上清液获得重组病毒,测定病毒滴度;病毒颗粒转染PC12细胞,经嘌呤酶素筛选获得稳定感染细胞株;Western blot检测LAMP-2A和TSG101蛋白的表达;分别采用LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1下调PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达,并结合巴佛洛霉素A1处理,研究其对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP、α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的影响,免疫荧光检测各组PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达。结果成功构建干扰LAMP-2A和TSG101表达的慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒。重组病毒感染PC12细胞后,Western blot检测结果显示LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1干扰效果最好;下调LAMP-2A和TSG101蛋白表达均能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的降解(P<0.01),并提高LC3-Ⅱ蛋白的含量(P<0.01)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地沉默PC12细胞中LAMP-2A和TSG101的表达,抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)的降解。

新风胶囊通过调节自噬相关蛋白的表达改善佐剂关节炎大鼠的肺功能

目的观察新风胶囊(XFC)对佐剂关节炎(AA)大鼠滑膜、肺组织自噬相关基因(ATG)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和beclin 1的影响。方法将大鼠随机分为正常对照(NC)组、模型对照(MC)组、来氟米特(LEF)组、XFC组,每组10只,除NC组外均将Freund完全佐剂(0.1 m L/只)注射于每只大鼠右后足跖皮内以致炎,第10天在尾根部注射Freund完全佐剂0.05 m L加强免疫,复制AA模型。致炎后第13天给药。NC组、MC组给予生理盐水灌胃,每天1次;LEF、XFC组给予相应药物灌胃,每天1次,连续给药30 d。观察大鼠足跖肿胀度、关节炎指数、肺功能,ELISA检测血清细胞因子B细胞刺激因子(BAFF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4、IL-10表达,透射电镜观察滑膜、肺组织自噬小体,反转录PCR检测大鼠滑膜、肺组织ATG5、ATG7、ATG12 mRNA,Western blot法检测大鼠滑膜、肺组织LC3-Ⅱ、beclin 1的蛋白表达。结果 XFC组大鼠肺功能参数、血清IL-4、IL-10表达升高;滑膜、肺组织自噬体及自噬溶酶体较MC组增加;血清IL-1β、BAFF表达及滑膜组织ATG7、ATG12 mRNA降低,肺组织ATG5、ATG7 mRNA降低,ATG12 mRNA升高;滑膜组织、肺组织LC3-Ⅱ、beclin 1升高。结论 XFC通过调节AA大鼠滑膜、肺组织细胞自噬,改善肺功能。

GTF2H2基因变异体与脊髓性肌萎缩症的相关性

目的基于MLPA的检测结果探讨GTF2H2基因的两个变异体与脊髓性肌萎缩症(SMA)的关系。方法利用MLPA技术对317例连续样本进行SMA的决定基因SMN1、修饰基因NAIP与SMN2以及位置相邻基因RAD17、SERF1B及GTF2H2拷贝数检测。根据有无基因转换,对纳入的数据利用相关与回归分析的统计方法进行探讨分析。结果 Spearman's相关性分析显示,纳入分析的223例连续样本的T-GTF2H2与NAIP基因的相关系数为0.694;线性回归显示,GTF2H2基因对NAIP基因的决定系数(R^2)为0.554,调整R^2为0.549,T-GTF2H2变异体的标准回归系数(β)为0.768,而C-GTF2H2变异体的β为-0.052。结论 T-GTF2H2变异体与NAIP基因呈正相关,进而说明T-GTF2H2变异体在SMA致病的分子机制过程中有一定的作用。

miR-362及LncRNA SNHG12表达与IL-17甲基化与宫颈癌患者hr-HPV感染相关性

目的探讨微小核糖核酸-362(miR-362)及长链非编码核糖核酸(RNA)小核仁RNA宿主基因12(Ln-cRNA SNHG12)表达水平、白细胞介素-17(IL-17)甲基化阳性率与宫颈癌(CC)患者高危型人乳头瘤病毒(hr-HPV)感染的相关性及生物学意义.方法选取2019年1月—2023年8月天津市第五中心医院收治的168例CC患者作为A组,同期收治的170例宫颈上皮内瘤变患者作为B组,180名同期健康体检女性志愿者作为C组;比较三组临床资料、hr-HPV感染率、宫颈组织miR-362、LncRNA SNHG12表达水平、IL-17甲基化阳性率,hr-HPV感染阳性、阴性宫颈组织miR-362及LncRNA SNHG12表达水平、IL-17甲基化阳性率,CC患者宫颈组织miR-362及LncRNA SNHG12表达水平、IL-17甲基化阳性率与hr-HPV感染阳性的相关性采用Spearman法进行分析,比较不同临床病理特征宫颈组织miR-362及LncRNA SNHG12表达水平,不同IL-17甲基化状态CC临床病理特征.结果A组宫颈组织miR-362表达水平低于B组、C组,B组低于C组;A组宫颈组织LncRNA SNHG12表达水平高于B组、C组,B组高于C组;三组IL-17甲基化阳性率分别为68.45%、52.35%、37.78%,差异有统计学意义(P<0.05);hr-HPV感染阳性CC患者宫颈组织miR-362水平低于hr-HPV感染阴性CC患者;宫颈组织LncRNA SNHG12表达水平高于hr-HPV感染阴性CC患者;IL-17甲基化阳性率为72.54%,高于hr-HPV感染阴性CC患者的46.15%(P<0.05);CC患者宫颈组织miR-362表达水平与hr-HPV感染阳性呈负相关(r=-0.565,P<0.05);宫颈组织LncRNA SNHG12表达水平、IL-17甲基化阳性率与hr-HPV感染阳性呈正相关(r=0.498、0.512,P<0.05);IL-17甲基化阳性患者肿瘤高分化程度的占比为60.87%,高于IL-17甲基化阴性患者的39.62%(P<0.05).结论宫颈组织miR-362、LncRNA SNHG12表达水平、IL-17甲基化阳性率与CC的发生及hr-HPV密切相关,且与患者临床病理特征存在一定关联.

IL-12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠肝癌的研究

目的 研究L-12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granalocyte-macrophage-colong scimulatingfactor,GM-CSF)联合基因治疗对小鼠皮下肝癌的治疗作用。方法 将皮下接种1×106BNL肝癌细胞的小鼠分四组于肿瘤接种3、6d后分别经尾静脉高压注射总量为25μg的细胞因子编码质粒:(1)pXX-GM-CSF、pXX-IL-12各 12.5μg;以pXX-IL-12 25μg;(3)pXX-GM-CSF 25μg;(4)pXX-Neo 25μg,每组6只小鼠。观察小鼠皮下肿瘤生长情况及所诱导的细胞免疫反应。同时研究了经尾静脉高压注射后小鼠血清IL-12、GM-CSF和IFN-γ浓度变化。结累IL-12与GM-CSF联台基因治疗可以诱导更强的抗肝癌免疫和细胞免疫反应。GM-CSF可以增强IL-12分泌并减少其诱导的IFN-γ分泌。结论IL-12和GM-CSF联台基因治疗可以产生较强的抗瘤作用并能减少IL-12的副作用。

突发性耳聋患者血清Atg5、Atg12、LC3水平与病情严重程度和预后的关系

目的研究突发性耳聋(SD)患者血清自噬相关基因5(Atg5)、自噬相关基因12(Atg12)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)水平与病情严重程度和预后的关系。方法选择2021年1月至2023年12月南方医科大学顺德医院附属杏坛医院收治的200例SD患者作为研究的SD组,另取同期进行健康体检的80名志愿者作为对照组。检测两组受试者的血清Atg5、Atg12、LC3水平。根据纯音平均听阈(PTA)将SD患者分为轻度听力损失、中度听力损失、重度听力损失、极重度听力损失四个亚组;根据SD患者的预后分为预后不良和预后良好。采用logistic回归分析SD患者预后的影响因素。结果SD组患者的血清Atg5、Atg12、LC3水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);SD组中不同病情严重程度患者的血清Atg5、Atg12、LC3水平比较如下:轻度听力损失亚组>中度听力损失亚组>重度听力损失亚组>极重度听力损失亚组,差异有统计学意义(P<0.05);SD组患者的血清Atg5、Atg12、LC3水平与PTA的相关性为负相关(P<0.05);SD组中预后不良患者的年龄、病程、全聋型比例均高于治疗预后良好患者,血清Atg5、Atg12、LC3水平低于预后良好患者,差异均有统计学意义(P<0.05);logistic回归分析显示,年龄增加、病程延长、全聋型及血清Atg5、Atg12、LC3水平降低是SD患者预后不良的独立影响因素(P<0.05)。结论SD患者的血清Atg5、Atg12、LC3水平增加且与病情严重程度、预后相关。

肿瘤相关巨噬细胞外泌体lnc-SLC2A12-10:1调节miR-296-5p促进乳腺癌细胞增殖、侵袭

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)外泌体中lnc-SLC2A12-10:1对乳腺癌(breast cancer,BC)细胞增殖、侵袭的影响及其机制。方法GEO芯片分析BC中差异表达的lnc-SLC2A12-10:1,qRT-PCR测定lnc-SLC2A12-10:1、miR-296-5p在组织和细胞中的表达。分离TAMs及外泌体。干预外泌体中lnc-SLC2A12-10:1及细胞中的miR-296-5p的表达后借助MTT、Transwell试验检测细胞增殖及侵袭情况。结果相对于癌旁组织,lnc-SLC2A12-10:1在BC组织中显著上调(t=7.09,P<0.001)。与正常乳腺细胞比较,T47D、MDA-MB-468细胞中lnc-SLC2A12-10:1的表达均明显上调(t=9.90,P<0.001)(t=12.18,P<0.001)。lnc-SLC2A12-10:1能作为miR-296-5p的ceRNA。敲减lnc-SLC2A12-10:1能够抑制BC细胞增殖、侵袭,miR-296-5p-inhibitor能促进BC细胞增殖、侵袭,但该作用能被si-lnc-SLC2A12-10:1-Exo部分挽救(均P<0.05)。结论TAMs外泌体中携带的lnc-SLC2A12-10:1能促进BC细胞增殖、侵袭,从而推进BC的进展。

口服携带人IL-12、GM-CSF基因的减毒沙门菌抗肿瘤作用的试验

目的 探讨以减毒沙门菌作为口服基因治疗载体的可行性。方法 通过电转化法将真核表达载体pCMVhIL 12、pCMVhGM CSF、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL32 6 1中 ,经由胃管喂给BALB c和C5 7BL 6小鼠。 6周后分别用 4T1乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击。通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达 ,通过PCR和ELISA法检测IL 12、GM CSF基因的整合和表达情况。并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期。结果 在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合。血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高 (P <0 .0 5 ) ,生存期远远超过对照组小鼠 (P <0 .0 5 )。结论 减毒沙门菌可作为口服基因治疗载体 ,可能为肿瘤的治疗提供一条简便、安全。

苯乙基异硫氰酸酯对良性前列腺上皮细胞增殖凋亡的影响及相关机制研究

目的探讨苯乙基异硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)对人类良性前列腺上皮细胞(benign prostatic hyperplasia cell line,BPH-1)增殖与凋亡的影响及其相关机制。方法体外培养人永生化前列腺上皮细胞,给予6、12、24μmol/L PEITC或等量溶剂二甲基亚砜,分别作用6、12、24 h。采用CCK-8检测前列腺上皮细胞活性;Annexin V及PI标记,流式细胞技术检测PEITC处理24 h后BPH-1细胞凋亡及坏死比例;Western blotting测定PEITC处理24 h后BPH-1细胞中X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)及自噬相关蛋白5-12(Atg5-12)表达变化;RT-PCR检测PEITC处理24 h后BPH-1细胞中XIAP mRNA表达情况。结果(1)BPH-1细胞经过6、12、24μmol/L PEITC处理6 h后,细胞相对活性分别为71.22%、48.90%、13.57%;处理12 h后分别为52.57%、42.37%、10.11%;处理24 h后分别为36.73%、25.88%、8.39%;处理36 h后分别为33.57%、25.83%、13.06%,呈现浓度依赖性和时间依赖性。(2)BPH-1细胞在6、12、24μmol/L PEITC处理24 h后,细胞凋亡率分别为19.5%、30.4%、40.1%;与对照组相比,12、24μmol/L处理组差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)BPH-1细胞在6、12、24μmol/L PEITC处理24 h后,XIAP蛋白表达量及mRNA表达量均下调,Atg5-12蛋白表达量下调,并呈现剂量依赖性。结论PEITC可抑制前列腺上皮细胞增殖,通过下调BPH-1中XIAP mRNA而降低XIAP蛋白表达,促进前列腺上皮细胞的凋亡并呈现出剂量依赖性;同时PEITC下调了自噬相关蛋白Atg5-12;PEITC对凋亡与自噬的调节可能存在相关性。