三结构域蛋白21通过下调自噬相关蛋白4B抑制肝细胞癌细胞增殖的实验研究

目的探讨三结构域蛋白21(tripartite motif 21,TRIM21)抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖的可能机制。方法采用TCGA数据库的样本数据分析TRIM21在HCC组织中的表达水平;Western blot检测HCC细胞系中TRIM21表达情况,在HepG2细胞中过表达TRIM21,并在SMMC7721细胞中敲低TRIM21;CCK-8和细胞克隆形成实验分别检测过表达和敲低TRIM21对HepG2和SMMC7721细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的情况;Western blot检测TRIM21对自噬相关蛋白4B(autophagy related 4B,ATG4B)水平的影响;分别在HepG2细胞中下调ATG4B表达和在SMMC7721细胞中过表达ATG4B,CCK-8检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞周期变化。结果 TRIM21在HCC组织中的表达水平较正常肝组织显著下调(n=49,P<0.05);在HepG2细胞中过表达TRIM21能显著降低细胞存活率(P<0.01)、抑制细胞增殖(P<0.01),在SMMC7721细胞中下调TRIM21的表达能显著增加细胞存活率(P<0.05)、促进细胞增殖(P<0.05)。过表达或敲低TRIM21对HCC细胞凋亡影响不明显;TRIM21在HCC细胞中可以抑制ATG4B的表达;而在HCC细胞中过表达或下调ATG4B也可以发挥促进或抑制细胞增殖的效果(P<0.05),ATG4B影响HCC细胞增殖的机制主要是改变细胞周期进程。结论 TRIM21在HCC中可通过下调ATG4B而抑制细胞增殖。

盐酸吡柔比星通过上调ATG4B增强HeLa细胞保护性自噬

目的探讨盐酸吡柔比星增强宫颈癌He La细胞自噬水平的可能机制。方法采用CCK-8检测盐酸吡柔比星单独或联用自噬抑制剂氯喹对He La细胞增殖的影响;台盼蓝染色实验检测盐酸吡柔比星单独或联用自噬抑制剂氯喹对He La细胞死亡的影响;GFP-LC3质粒转染He La细胞后观察盐酸吡柔比星对自噬小体形成的影响;Western blot检测细胞中自噬标志分子Ⅱ型微管相关蛋白轻链3(microtuble-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、自噬相关分子自噬相关蛋白4B(autophapy related 4B,ATG4B)的表达情况。CCK-8实验及台盼蓝染色实验观察在有或者无自噬抑制剂氯喹作用下以及shRNA下调He La细胞中的ATG4B后盐酸吡柔比星对He La细胞的杀伤效应的影响。结果盐酸吡柔比星能剂量依赖地抑制He La细胞的增殖并促进其死亡(P<0.05);盐酸吡柔比星处理能显著增加He La细胞中自噬小体的数量,并显著上调自噬标志分子LC3-II、自噬关键酶ATG4B的表达;自噬抑制剂氯喹可显著增强盐酸吡柔比星的杀细胞效应(P<0.05),shRNA干扰ATG4B可抑制盐酸吡柔比星对He La细胞中自噬的增强作用(P<0.05),并增强盐酸吡柔比星的杀细胞效应(P<0.05)。结论盐酸吡柔比星通过上调ATG4B而增强的自噬对He La细胞起保护作用。

人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定

目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。

Atg4B基因调控自噬在高危型HPV致宫颈癌中的作用和机制研究

目的研究自噬相关蛋白4同源物B(Atg4B)基因调控自噬在高危型人乳头瘤病毒(HPV)致宫颈癌中的作用和机制。方法培养宫颈癌C33a细胞,构建pcDNA3.1-Atg4B质粒并转染C33a细胞。采用免疫印迹实验检测Atg4B蛋白的表达水平,采用^(3)H-胸腺嘧啶核苷酸渗入法检测C33a细胞增殖数目,采用Transwell实验检测细胞迁移数目,采用透射电镜观察自噬小体的形成数目。结果HR-HPV E6组C33a细胞增殖数目、Atg4B蛋白表达水平及自噬小体数目分别为(5208.12±859.33)cpm/孔、(0.62±0.13)及(7.67±0.58)个/视野,HR-HPV E6 mut组C33a细胞增殖数目、Atg4B蛋白表达水平及自噬小体数目分别为(2095.41±194.67)cpm/孔、(0.14±0.06)及(0.67±0.58)个/视野,Mock组C33a细胞增殖数目、Atg4B蛋白表达水平及自噬小体数目分别为(3496.89±568.14)cpm/孔、(0.32±0.08)及(3.67±0.58)个/视野,与mock组比较,HR-HPV E6组C33a细胞增殖数目、Atg4B蛋白表达水平及自噬小体数目显著增加(t=2.878,3.320,8.485,均P<0.05),HR-HPV E6 mut组C33a细胞增殖数目、Atg4B蛋白表达水平及自噬小体数目显著减少(t=4.040,3.118,6.364,均P<0.05)。pcDNA3.1 Atg4B组C33a细胞增殖数目和自噬小体数目分别为(4917.23±425.16)cpm/孔和(5.67±0.58)个/视野,pcDNA3.1空载体组C33a细胞增殖数目和自噬小体数目分别为(1989.76±243.15)cpm/孔和(1.67±0.57)个/视野,两组比较差异均有统计学意义(t=10.352,8.485,均P<0.05)。HR-HPV E6+BafA1组C33a细胞增殖、迁移及自噬小体数目分别为(1667.22±203.76)cpm/孔、(189.15±20.21)个及(2.67±0.58)个/视野,HR-HPV E6+DMSO组C33a细胞增殖、迁移及自噬小体数目分别为(4583.81±592.24)cpm/孔、(467.73±58.63)个及(7.33±0.58)个/视野,两组比较差异均有统计学意义(t=8.066,7.752,9.899,均P<0.05)。结论Atg4B基因调控细胞自噬小体的形成,进而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移,在HR-HPV致宫颈癌发生、发展中发挥重要作用。

细胞自噬与高危型人乳头瘤病毒感染致宫颈癌的临床病理特征和相关性

目的探讨细胞自噬的发生与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染致宫颈癌的临床病理特征和相关性,为宫颈癌早期筛查、诊断及预后评估的生物学标记物探索提供理论参考依据。方法选取2019年1月—2021年12月牡丹江医学院附属红旗医院妇科收治的60例浸润性宫颈癌患者为宫颈癌组,随机选取同期60例慢性宫颈炎患者为宫颈炎组;采用实时荧光定量PCR检测HR-HPV E6、自噬相关蛋白4同源物B(Atg4B)基因的表达;采用免疫印迹试验对LC3-I和LC3-II蛋白的表达进行检测;透射电镜下观察宫颈组织中自噬小体形成的数目;采用Spearman相关系数进行相关性分析。结果宫颈癌组织中HR-HPV E6、Atg4B基因的表达水平及LC3-II/I比值显著高于宫颈炎症组织,差异有统计学意义(t=3.791,4.372,3.219,均P<0.05);追踪自噬体数目结果显示,宫颈癌组织中自噬体数量显著高于宫颈炎症组织,差异有统计学意义(t=4.875,P<0.01)。HR-HPV E6、Atg4B基因表达、LC3-II/I比值及自噬体数目均与宫颈癌患者的年龄无明显相关性(P>0.05);HR-HPV E6(r=0.214,0.128,0.443)、Atg4B基因表达(r=3.257,0.433,1.569)、LC3-II/I比值(r=4.376,0.436,2.429)及自噬体数目(r=1.329,0.461,3.178)与宫颈癌的临床分期、组织病理学类型及淋巴结转移存在明显正相关性(均P<0.05)。结论细胞自噬及其相关蛋白与HR-HPV感染致宫颈癌的临床病理特征密切相关,有望成为宫颈癌早期筛查、诊断及预后评估的重要生物标记物。