载脂蛋白A-I模拟肽D4F通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡

目的:探讨载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,Apo A-I)模拟肽D4F对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予12.5、25和50 mg/L D4F、5 mmol/L ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)或5μmol/L二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI)预处理1 h后,再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)继续培养24 h。MTT法检测细胞活力;TUNEL法检测细胞凋亡情况;试剂盒测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性;Western blot法检测caspase-12的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似,D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬细胞活力降低和凋亡,且呈浓度依赖性(P<0.05)。与氧化应激抑制剂DPI相似,D4F显著抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应,表现为ROS和MDA生成减少(P<0.01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P<0.05);与PBA和DPI相似,D4F可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞caspase-12活化,且呈浓度依赖性(P<0.05);另外,D4F还可抑制TM诱导的caspase-12活化(P<0.05)。结论:D4F能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其机制至少部分是通过减轻氧化应激继而抑制caspase-12活化实现的。

CD68和Sema 4D蛋白在胃癌组织中的表达相关性及临床意义

目的:比较肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)标记抗原CD68和轴突导向因子4D(Sema4D)在胃癌组织和正常组织中的表达,探讨两者之间的相关性及临床意义。方法:采用免疫组织化学SP法检测86例胃癌组织和癌旁正常组织中CD68和Sema4D的表达,并分析其与临床病理特征的关系。结果:胃癌组织中CD68和Sema4D蛋白阳性表达率显著高于癌旁组织(72.1%vs23.3%和74.4%vs29.1%,均P<0.01)。CD68和Sema4D蛋白与胃癌组织分化类型、TNM分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05),且两者表达呈正相关(r=0.467,P<0.01)。结论:胃癌组织中CD68和Sema4D表达明显增高,且呈显著正相关,两者的联合检测有助于预测胃癌的发展趋势。

肿瘤相关巨噬细胞和Sema4D与胃癌浸润转移的关系

目的:研究肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对人胃癌SGC-7901细胞系生物学功能的影响。方法 :采用佛波酯(PMA)、白细胞介素IL-4和IL-13体外诱导人M2型巨噬细胞,细胞免疫荧光鉴定TAMs。Transwell非接触式共培TAMs和胃癌SGC-7901细胞,侵袭实验、迁移实验检测肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)检测实验组和空白对照组胃癌SGC-7901细胞上清中分泌型Sema4D的变化。结果:细胞免疫荧光鉴定M2型巨噬细胞诱导成功;在Transwell共培养体系中,TAMs共培养的胃癌SGC-7901细胞形态学发生改变;Transwell侵袭实验、迁移实验表明,细胞侵袭转移力增强(P<0.01)。与TAMs共培养的胃癌SGC-7901细胞的上清液分泌型Sema4D蛋白明显增多,较空白对照组差异有统计学意义(1224.13±29.43比637.15±33.84,P<0.01)。结论 :TAMs可促进胃癌细胞的浸润转移,其原因可能与分泌型Se m a4D蛋白的表达上调有关。

沉默轴突导向蛋白4D对胃癌细胞SGC-7901生长、自噬及上皮-间质转化的影响

目的探讨沉默轴突导向蛋白4D(Sema4D)对胃癌细胞SGC-7901生长、自噬及上皮-间质转化的影响。方法将SGC-7901细胞随机分为对照组、shRNA-NC组、Sema4D-shRNA1组、Sema4D-shRNA2组与Sema4D-shRNA3组,构建shRNA Sema4D载体转染至SGC-7901细胞。采用RT-PCR检测各组Sema4D mRNA表达水平;采用克隆形成实验检测细胞克隆形成率;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;显微镜观察上皮-间质转化形态学变化;Western blotting检测Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表达水平。结果 RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,Sema4D-shRNA1组、Sema4D-shRNA2组和Sema4D-shRNA3组Sema4D mRNA表达水平均明显降低,且Sema4D-shRNA3组明显低于Sema4D-shRNA1组和Sema4D-shRNA2组(P<0.05),选择Sema4D-shRNA3进行后续试验。克隆形成实验结果显示,与对照组比较,Sema4D-shRNA3组克隆形成率明显降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与对照组比较,Sema4D-shRNA3组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与对照组比较,Sema4D-shRNA3组Ki-67、PCNA、p62、N-cadherin、波形蛋白表达水平明显降低,Beclin1、E-cadherin蛋白表达水平明显升高,Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P<0.05)。显微镜观察可见Sema4D-shRNA3组细胞上皮-间质转化受到抑制。结论 shRNA Sema4D可抑制SGC-7901细胞的增殖、自噬、上皮-间质转化,促进其凋亡。

脑信号蛋白Sema4D 及炎症因子在乙肝相关性肝癌患者中的表达及其意义

目的探究脑信号蛋白Sema4D及炎症因子在乙肝相关性肝癌患者中的表达及其意义。方法选取2017年1月-2018年12月我院肝病中心收治的41例乙肝相关性肝癌患者作为观察组,同期在我院体检的41例健康者作为对照组。检测并比较两组研究对象的脑信号蛋白Sema4D的表达水平,评估血清IL-8和IL-6水平的变化,同时探究Sema4D表达水平与炎症因子之间的相关性。结果观察组患者血清Sema4D、IL-8、IL-6水平均显著高于对照组(P<0.05);血清Sema4D水平与血清IL-8、IL-6水平呈正相关(r=0.935,P=0.002;r=0.912,P=0.016);单因素Logistic分析显示Sema4D表达水平升高是乙肝相关性肝癌发生的独立危险因素(OR=1.25,95%CI=1.04~1.87,P<0.001)。结论脑信号蛋白Sema4D可通过影响机体炎症反应水平,影响机体的神经内分泌功能及免疫系统功能,从而参与乙肝相关性肝癌的发生发展。

膀胱癌微环境中轴突导向因子4D在肿瘤相关巨噬细胞表达的研究分析

目的探讨膀胱癌微环境中轴突导向因子4D(semaphorins 4D,Sema4D)在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)上的表达特点。方法膀胱癌细胞系T24与M0型巨噬细胞共培养,通过实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同表型巨噬细胞及共培养组巨噬细胞中Sema4D表达量;收集37例膀胱癌患者的临床资料、病理肿瘤组织和10例癌旁正常组织,应用免疫组化染色法和免疫荧光双标法检测CD163、Sema4D表达量,对TAM浸润性及其Sema4D表达率进行临床验证。结果极化诱导以及共培养后,PCR结果显示M2型巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞,差异均有统计学意义(P=0.0190,P=0.0180),T24+M0组巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞,差异均有统计学意义(P=0.0066,P=0.0254);ELISA结果显示M2型巨噬细胞中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞,差异均有统计学意义(P=0.0052,P=0.0058),T24+M0组巨噬细胞培养上清液中Sema4D的表达量明显高于M0和M1型巨噬细胞,差异均有统计学意义(P=0.0026,P=0.0269)。肿瘤组织中CD163^(+)细胞计数高于癌旁正常组织(36.05±14.56 vs.12.10±5.70),差异有统计学意义(P<0.01);肿瘤组织中Sema4D表达高于癌旁正常组织(39.14±12.34 vs.11.00±4.65),差异有统计学意义(P<0.01),且肿瘤组织中Sema4D^(+)TAM百分比高于癌旁正常组织(67.44±13.74 vs.21.04±1.80),差异有统计学意义(P<0.0001)。肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)组织中CD163+细胞计数和Sema4D表达均高于癌旁正常组织(43.37±12.48 vs.28.33±11.98;48.78±10.18 vs.34.74±12.59),差异有统计学意义(P=0.0009,P=0.0258),且MIBC组织中Sema4D^(+)TAM百分比高于非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive blad-der cancer,NMIBC)组织(70.78±11.74 vs.60.58±12.05),差异有统计学意义(P=0.0160)。TAM浸润性(CD163^(+)细胞计数)及其Sema4D表达率与肿瘤T分期均呈正相关(P=0.0025,P=0.0201),与病理分级均呈正相关(P=0.0090,P=0.0031),但与患者性别、年龄和肿瘤最大直径均无相关性(P>0.05)。结论膀胱癌微环境中,M2型巨噬细胞表达Sema4D,可能导致膀胱癌增殖和侵袭。M2型巨噬细胞浸润性及其Sema4D表达率与膀胱癌发生和肌层浸润密切相关。

轴突导向蛋白4D在肿瘤发病中的作用及对结直肠癌的意义

轴突导向蛋白4D(Semaphorin4D,Sema4D)是轴突导向蛋白Ⅳ亚族(SemasⅣ)的重要成员之一,包括游离型及膜结合型,研究表明,其在结直肠癌患者的肿瘤生长及转移等方面有重要的生物学功能。介绍Sema4D在结直肠癌中的研究进展。

可溶性微纤维相关蛋白4、白三烯D4及干扰素γ对儿童哮喘筛查及病情评估价值比较

目的比较可溶性微纤维相关蛋白4(sMFAP4)、白三烯D4(LTD4)及干扰素γ(IFN-γ)对儿童哮喘筛查及病情评估的价值。方法选取2019年1月至12月于武汉市新洲区人民医院儿科收治的100例哮喘患儿作为哮喘组(包括哮喘急性发作期50例,临床缓解期50例),另收集50例年龄和性别相匹配的体检健康儿童作为健康人对照组。采用ELISA法检测2组血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ的浓度。ROC曲线评估血清sMFAP4、LTD4、IFN-γ及联合检测对儿童哮喘筛查及病情评估价值。结果哮喘组患儿急性发作期血清sMFAP4浓度显著高于健康人对照组(3.85±0.83 vs 1.53±0.38 ng/mL,t=9.34,P<0.01)和临床缓解期患儿(3.85±0.83 vs 2.49±0.76 ng/mL,t=10.68,P<0.01)。哮喘组患儿急性发作期血清的LTD4浓度显著高于健康人对照组(16.89±4.03 ng/mL vs 5.49±3.53 ng/mL,t=8.96,P<0.01)和临床缓解期患儿(16.89±4.03 vs 11.89±3.92,t=12.13,P<0.01)。哮喘组患儿急性发作期血清IFN-γ浓度明显低于健康人对照组(46.26±14.77 vs 80.55±16.88 ng/mL,t=9.96,P<0.01)和临床缓解期患儿(46.26±14.77 vs 71.25±10.95 ng/mL,t=13.76,P<0.01)。血清sMFAP4筛查儿童哮喘症的ROC曲线下面积(AUC^(ROC))为0.85,当cut-off值为2.06 ng/mL时,敏感性为82.90%,特异性为87.80%;血清IFN-γ筛查儿童哮喘症的AUC^(ROC)为0.72,当cut-off值为60.34 ng/mL时,95%CI为0.66~0.84,敏感性为74.50%,特异性为84.90%;血清LTD4筛查儿童哮喘症的AUC^(ROC)为0.78,当cut-off值为9.06 ng/mL时,95%CI为0.73~0.84,敏感性为78.10%,特异性为89.70%;sMFAP4、IFN-γ、LTD4三者联合筛查儿童哮喘症的AUC^(ROC)为0.94,95%CI为0.84~0.94,敏感性为90.50%,特异性为93.90%。血清sMFAP4区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC^(ROC)为0.83,当cut-off值为2.67 ng/mL时,敏感性为84.50%,特异性为83.90%;血清IFN-γ区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC^(ROC)为0.70,当cut-off值为80.44 ng/mL时,95%CI为0.64~0.72,敏感性为60.90%,特异性为75.80%;血清LTD4区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC^(ROC)为0.74,当cut-off值为13.67 ng/mL时,95%CI为0.68~0.75,敏感性为69.90%,特异性为79.80%;联合检测sMFAP4、IFN-γ、LTD4三者区分儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC^(ROC)为0.90,95%CI为0.84~0.95,敏感性为89.90%,特异性为91.80%。结论sMFAP4对儿童哮喘具有较好的筛查及鉴别急性发作期和临床缓解期效能,联合检测的筛查效能更优。

血清Sema4D水平与类风湿性关节炎患者继发肺间质病变的相关性

目的探讨血清信号素4D(Sema4D)在类风湿性关节炎(RA)患者中的表达,并分析Sema4D与RA患者继发肺间质病变(ILD)的关系。方法选择2017年1月—2020年6月本院收治的67例完成治疗及随访的RA患者资料,设为RA组;另选取同期本院收治的67例完成治疗及随访的RA继发ILD患者资料,将其设为RA继发ILD组。所有纳入患者均于入院时接受实验室指标检测,且检测结果资料完整。重点记录患者血清Sema4D表达,分析血清Sema4D与RA患者继发ILD的关系。结果RA继发ILD组血清Sema4D、血管内皮生长因子(VEGF)及类风湿性因子(RF)表达均高于RA组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,入院时血清Sema4D、VEGF过表达与RA患者ILD有关,可能作为RA患者ILD发生的风险因子,差异有统计学意义(OR>1,P<0.05);绘制受试者工作特征(ROC)曲线,入院时血清Sema4D、VEGF预测RA患者ILD发生风险价值的曲线下面积(AUC)分别为0.892、0.781,均有一定预测价值,且当二者的临界值分别取33.34μg/L、168.79 ng/L时,可获得最佳预测价值。结论入院时血清Sema4D过表达可能与RA患者ILD有关,早期监测患者血清Sema4D表达,对预测RA患者ILD的发生有一定价值。

血清Sema4D、BMP-4、AFU与乙肝相关肝癌患者临床病理特征及预后的关系

目的研究乙肝相关原发性肝癌(PHC)患者血清轴突导向因子4D(Sema4D)、骨形成蛋白4(BMP-4)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)水平与临床病理特征及预后生存情况的关系。方法选取青海省海西自治州人民医院2015年1月至2017年1月收治的乙肝相关PHC患者120例、乙肝肝硬化患者60例、慢性乙肝患者60例及健康志愿者60例为对照组,比较4组的血清Sema4D、BMP-4、AFU水平,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析Sema4D、BMP-4、AFU诊断乙肝相关PHC的临界值,分析血清Sema4D、BMP-4、AFU水平与乙肝相关PHC患者临床病理特征及预后生存时间的关系。结果对照组、慢性乙肝组、乙肝肝硬化组、乙肝相关PHC组的血清Sema4D、AFU水平呈逐级升高趋势(P<0.05);对照组的BMP-4水平高于乙肝肝硬化组和乙肝相关PHC组,低于慢性乙肝组,乙肝相关PHC组的BMP-4水平低于乙肝肝硬化组(P<0.05)。ROC曲线显示,Sema4D、BMP-4、AFU诊断乙肝相关PHC具有较好的临床价值,根据Sema4D、BMP-4、AFU诊断乙肝相关PHC的临界值9.5 ng/ml、31.4 pg/ml及67.2 U/L,将分为高水平组和低水平组,两组性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤数目、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性率差异无统计学意义(P>0.05);两组TNM分期、Child-Pugh分级、是否侵犯血管、有无腹水差异有统计学意义(P<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤数目、HBsAg阳性乙肝相关PHC患者的中位生存时间(MST)比较差异无统计学意义(P<0.05);不同TNM分期、Child-Pugh分级、是否侵犯血管、有无腹水及血清Sema4D、BMP-4、AFU水平乙肝相关PHC患者的MST比较差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、Child-Pugh分级B级、侵犯血管、血清Sema4D、AFU水平异常升高及BMP-4水平异常降低为乙肝相关PHC患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)。结论PHC患者血清Sema4D、AFU水平升高、BMP-4水平降低,Sema4D、BMP-4、AFU与肿瘤发生发展存在密切关系,并可作为PHC患者的预后评估指标。

慢病毒干扰SKA1对前列腺癌PC-3细胞增殖及CDK4和cyclin D1表达的影响

目的探究慢病毒介导纺锤体和动粒相关蛋白1(SKA1)沉默对前列腺癌PC-3细胞增殖及细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)水平的影响。方法构建慢病毒表达载体Lv-shSKA1,转染PC-3细胞。实验分为空白组、Lv-shCon组和Lv-shSKA1组。用实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测细胞SKA1mRNA表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期,用蛋白质印迹(Western blot)技术检测SKA1、CDK4及cyclin D1蛋白表达。结果 (1)与LvshCon组比较,Lv-shSKA1组细胞中SKA1mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)。(2)与Lv-shCon组比较,Lv-shSKA1组细胞增殖速率显著较慢(P<0.05)。(3)与Lv-shCon组比较,Lv-shSKA1组G0/G1期细胞数显著减少(P<0.05),S期细胞数显著增加(P<0.05)。(4)与Lv-shCon组比较,Lv-shSKA1组细胞CDK4、cyclin D1蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)。结论慢病毒介导的SKA1沉默可抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,且细胞增殖相关蛋白CDK4、cyclin D1表达显著下调,提示SKA1可能是前列腺癌基因治疗的新靶点。

维生素D对PDCD4表达的调控作用研究

目的:探索维生素D对促炎因子程序性细胞死亡蛋白-4(PDCD4)的调控作用及其分子机制。方法:在巨噬细胞中采用不同剂量维生素D刺激,并在不同时间点进行检测,用实时定量PCR和蛋白质印迹方法确定维生素D刺激对PDCD4 mRNA和蛋白水平的影响,并进一步对PDCD4上游调控因子微小RNA-21(miR-21)进行检测,探索维生素D调节PDCD4的作用机制。最后在脂多糖诱导的炎症细胞模型中,通过蛋白质印迹方法验证维生素D在炎症状态下对PDCD4的调控作用。结果:在巨噬细胞中,维生素D的刺激能够上调miR-21表达,抑制PDCD4表达,而且在炎症模型中,维生素D的抑制作用更为显著。结论:维生素D通过上调miR-21抑制促炎症因子PDCD4的表达,为维生素D抑制炎症的发生提供新的理论依据。

慢性心力衰竭患者血清Lp-PLA2、sSema4D的表达及临床意义

目的分析慢性心力衰竭(CHF)患者血清脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、可溶性重组蛋白质类信号4D(sSema4D)的表达及临床意义。方法选取2018年4月-2019年4月黄冈市中心医院收治的CHF患者112例作为研究组,另选取体检健康者60例作为健康对照组。比较2组研究对象及不同NYHA分级CHF患者血清LpPLA2、sSema4D水平及超声心动图指标水平,分析CHF患者血清Lp-PLA2、sSema4D水平与超声心动图指标的相关性。结果研究组血清Lp-PLA2、sSema4D水平高于健康对照组(t=43.670、21.005,P均=0.000),左心房内径(LAD)、右心室内径(RVD)、左心舒张末期内径(LVEDD)大于健康对照组(t=16.903、11.183、13.885,P均=0.000);左心室射血分数(LVEF)及左心室短轴缩短率(LVFS)低于健康对照组(t=27.147、30.592,P均=0.000)。随着NYHA分级的升高,CHF患者血清Lp-PLA2、sSema4D水平及LAD、RVD、LVEDD明显增加(F=49.842、38.674、35.821、26.382、41.377,P均=0.000),而LVEF、LVFS明显下降(F=61.760、52.374,P均=0.000)。Pearson相关分析显示,CHF患者血清Lp-PLA2、s Sema4D水平与LAD、RVD、LVEDD均呈正相关(Lp-PLA2:r=0.562、0.514、0.613,P均=0.000;sSema4D:r=0.642、0.576、0.625,P均=0.000),而与LVEF、LVFS呈负相关(Lp-PLA2:r=-0.511、-0.472,P均=0.000;sSema4D:r=-0.507、-0.458,P均=0.000)。结论随着CHF患者心功能的恶化血清Lp-PLA2、sSema4D水平升高,并与超声心动图指标存在一定的相关性,提示Lp-PLA2和sSema4D可能通过影响心室重构参与到CHF的发生、发展。

基于KDM4D受体研究隔药饼灸抑制结肠炎相关性结肠癌肿瘤生长的作用机制

目的:从组蛋白赖氨酸去甲基化酶4D(KDM4D)的角度探究隔药饼灸抑制结肠炎相关性结肠癌(CAC)肿瘤生长的效应机制。方法:将近交系雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常组、CAC组、隔药饼灸组和抑制剂组。除正常组外,其余3组大鼠采用偶氮甲烷(AOM)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)制备CAC大鼠模型。正常组和CAC组不干预;隔药饼灸组大鼠取气海和双侧天枢,每次每穴灸2壮,每日1次,每周休息1 d,共30 d;抑制剂组予以KDM4D抑制剂5-氯-8-羟基喹啉(5-c-8HQ)腹腔注射,每日1次,共30 d。干预后观察各组大鼠的一般情况、结肠长度、瘤体数量和体积及结肠组织病理学变化。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测腺瘤样息肉病基因(APC)、体轴抑制因子(Axin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP)-7及MMP-9 mRNA的表达。免疫组化法检测结肠组织增殖细胞核抗原(PCNA)、cleaved caspase3、KDM4D、APC及Axin蛋白的表达。结果:与正常组相比,CAC组大鼠一般情况较差,结肠长度显著缩短(P<0.01),结肠组织瘤体数目增多、体积增大(P<0.01),可见腺管结构明显紊乱,出现“背靠背”及共壁现象,高级别腺癌形成;CAC组结肠组织PCNA及KDM4D蛋白表达水平显著升高(P<0.01),cleaved caspase3、APC及Axin蛋白表达水平显著降低(P<0.01),cyclin D1、MMP-7及MMP-9 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),APC及Axin mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与CAC组相比,隔药饼灸组与抑制剂组大鼠的一般情况改善,结肠长度显著增加(P<0.01),结肠瘤体数目减少、体积缩小(P<0.05),大鼠的结肠组织可见结肠上皮细胞增生,核增大且深染,异型增生,炎性细胞浸润。隔药饼灸组与抑制剂组大鼠结肠组织PCNA及KDM4D蛋白表达水平显著降低(P<0.01),cleaved caspase3、APC及Axin蛋白表达水平显著升高(P<0.01),cyclin D1、MMP-7及MMP-9 mRNA表达降低(P<0.05),APC及Axin mRNA表达升高(P<0.05)。结论:隔药饼灸能调控CAC大鼠的KDM4D异常表达,激活Wnt/β-catenin通路上游APC和Axin分子,抑制Wnt/β-catenin通路下游分子的异常激活,这可能是隔药饼灸抑制CAC肿瘤生长的关键机制之一。

人参、三七、川芎提取物对血管平滑肌细胞衰老相关β半乳糖苷酶及p16-cyclinD/CDK-Rb通路的影响

目的:观察人参、三七、川芎提取物延缓自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)衰老的作用及其可能的细胞周期调控机制。方法:取大鼠胸主动脉用于分离VMSC,采用原代细胞培养的方法建立SHR大鼠VMSC模型,实验分为Wistar-Kyoto(WKY)大鼠对照组、SHR模型组、缬沙坦组、中药低剂量组和中药高剂量组。采用衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色法观察细胞衰老情况,流式细胞仪分析细胞周期分布,逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测各组细胞p16、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)和成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)的表达。结果:SA-β-gal染色显示,与WKY组比较,SHR组SA-β-gal阳性细胞数明显增多(P<0.01),人参、三七、川芎提取物可使SHR VSMC SA-β-gal阳性细胞数明显减少(P<0.01);流式细胞仪检测显示,与WKY组比较,SHR组VSMC在G1期明显减少,S期细胞明显增加,中药干预后SHR的VSMC G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少(P<0.05);实时荧光定量聚合酶链式反应检测显示,与WKY组比较,SHR组VSMC的p16和Rb mRNA表达量明显减少,cyclin D1和CDK4mRNA表达增加;人参、三七、川芎提取物干预后SHR VSMC p16和Rb mRNA表达量增加,cyclin D1和CDK4mRNA减少。蛋白质印迹法显示,与WKY组比较,SHR组VSMC的p16蛋白表达量明显减少,cyclin D1、CDK4和磷酸化Rb蛋白表达量明显增加(P<0.05);中药干预后SHR VSMC p16蛋白表达增加,cyclin D1、CDK4和磷酸化Rb蛋白表达量减少(P<0.05)。结论:人参、三七、川芎提取物通过改变p16-cyclin D/CDK-Rb通路因子的表达而发挥延缓SHR VSMC衰老的作用。

RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制

目的探讨RNA结合锌指蛋白36(ZFP36)在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制。方法H9C2大鼠心肌细胞感染ZFP36过表达慢病毒(OE-ZFP36)或其阴性对照慢病毒(OE-ZFP36 NC)构建稳转细胞株;转染ATG4D过表达质粒(OE-ATG4D)提高ATG4D表达。H/R处理诱导心肌细胞损伤;将H9C2细胞分为对照组、H/R组、OE-ZFP36 NC+H/R组、OE-ZFP36+H/R组、OE-ATG4D NC+H/R组、OE-ATG4D+H/R组、OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组和OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组。各组细胞应用Western blotting检测ATG4D、Beclin1、LC3和ZFP36蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测ZFP36和ATG4D mRNA表达;CCK-8检测细胞活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平;SOD试剂盒检测SOD水平;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫荧光检测LC3自噬体;双荧光素酶报告基因实验检测ZFP36和ATG4D mRNA的结合。结果与对照组比较,H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平提高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加;ATG4D、Beclin1蛋白表达上调,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著增加;且ZFP36表达上调(P<0.05)。与OE-ZFP36 NC+H/R组比较,OE-ZFP36+H/R组中细胞活性提高,IL-6和TNF-α水平降低,ROS水平下降而SOD水平升高,细胞凋亡减少,且ATG4D、Beclin1蛋白表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著下调(P<0.05)。与感染OE-ZFP36 NC慢病毒比较,感染OE-ZFP36慢病毒降低ATG4D 3′-UTR报告基因的荧光素酶活性,降低ATG4D mRNA稳定性,下调H/R诱导的ATG4D mRNA表达(P<0.05)。与OE-ATG4D NC+H/R组相比,OE-ATG4D+H/R组中的ATG4D mRNA和蛋白表达显著上调,且细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。与OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组比较,OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。结论ZFP36在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调,过表达ZFP36抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤,并通过调控ATG4D抑制自噬,进而抵抗心肌细胞H/R损伤,证明ZFP36是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子。

饥饿诱导三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的自噬应答观察

目的观察饥饿诱导三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的自噬应答情况,并探讨其相关分子机制。方法将MDA-MB-231细胞分为四组,对照组加入DMEM培养液正常培养;Baf-A1组在DMEM培养液中加入100 nM的Baf-A1;EBSS(饥饿)组加入EBSS培养液;EBSS+Baf-A1(自噬阻断)组在EBSS培养液中加入100 nM的Baf-A1,四组均处理8 h后,分别采用实时荧光定量法和Western blotting法检测各组微管相关蛋白轻链3(LC3B)、自噬相关蛋白7(ATG7)和自噬相关蛋白4A(ATG4A)的mRNA及蛋白。结果与对照组比较,EBSS组LC3B、ATG7 mRNA相对表达量升高,ATG4A mRNA相对表达量降低;与EBSS组比较,EBSS+Baf-A1组LC3B mRNA相对表达量升高、ATG7 mRNA相对表达量降低,与Baf-A1组对比,EBSS+Baf-A1组中LC3B mRNA相对表达量增加,ATG7和ATG4A mRNA相对表达量降低。与对照组比较,EBSS组LC3BⅡ/LC3BⅠ升高,ATG4A蛋白表达降低;与EBSS组比较,EBSS+Baf-A1组LC3BⅡ/LC3BⅠ增加,ATG7蛋白表达降低;与Baf-A1组相比,EBSS+Baf-A1组LC3BⅡ/LC3BⅠ增加,ATG7蛋白表达降低。结论EBSS处理的MDA-MB-231细胞自噬水平升高,细胞自噬体形成增多,在此过程中EBSS可能通过增加ATG7 mRNA的表达量增加细胞自噬水平。

桔梗皂苷D对大鼠溃疡性结肠炎的改善作用及对TLR4/NOD信号通路蛋白表达的影响

【目的】探讨桔梗皂苷D对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及机制。【方法】将50只大鼠随机分为5组,包括正常组,模型组,桔梗皂苷D低、中、高剂量组,每组10只。除正常组大鼠给予蒸馏水饮用外,其他组大鼠通过在饮用水中施加5%硫酸葡萄糖钠(DSS)连续7 d诱导构建溃疡性结肠炎模型。实验第2~8周,桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠分别灌胃10、25、50 mg·kg^(-1)·d^(-1)桔梗皂苷D混悬液,正常组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水。给药期间,观察大鼠一般情况。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察结肠组织病理形态并进行组织学评分,Western Blot法检测结肠组织Toll样受体4(TLR4)/核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)通路相关蛋白TLR4、髓样分化因子88(MyD88)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达水平。【结果】(1)与正常组比较,模型组大鼠体质量、生存率、结肠长度和结肠质量均显著降低,疾病活动指数(DAI)评分显著升高(均P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠体质量、生存率、结肠长度和结肠质量均显著升高,DAI评分显著降低,其中,桔梗皂苷D中剂量组差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组结肠组织病理学评分升高(P<0.001);与模型组比较,桔梗皂苷D低、中、高剂量组结肠组织病理学评分均显著降低(P<0.05或P<0.01)。(3)与正常组比较,模型组中TLR4、MyD88和NLRP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D中剂量组的TLR4、MyD88和NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】桔梗皂苷D可改善大鼠溃疡性结肠炎,其机制与通过TLR4/NOD信号通路缓解肠道炎症有关。

慢性移植物肾病中C4d沉积与抗波形蛋白抗体的相关性

慢性移植物肾病（CAN）是导致移植肾丢失的主要原因[1],其中体液免疫是导致这一现象的主要因素之一[2].抗波形蛋白抗体是一种常见的非人类白细胞抗原（HLA）抗体及自身抗体,在CAN进展中检测到抗波形蛋白抗体的存在.沉积于肾微血管部位的C4d分子是抗体介导的排斥反应的标志物.本研究旨在探讨CAN进展中抗波形蛋白抗体与C4d沉积的相关性.

基因重组干扰素γ对呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿血清SP-D、TGF-β以及IL-4水平的影响

目的探讨基因重组干扰素γ对呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎患儿血清中肺表面活性蛋白D(SP-D)、转化生长因子(TGF)-β及白细胞介素4(IL-4)水平的影响。方法收集RSV毛细支气管炎患儿66例,另选取同期本院体检健康儿童30例作为对照组,将RSV毛细支气管炎患儿随机分为治疗1组和治疗2组各33例。治疗1组予常规干预,治疗2组在治疗1组基础上加基因重组干扰素γ。两组连续治疗1周,比较RSV毛细支气管炎患儿和对照组血清中SP-D、TGF-β及IL-4水平,检测患儿二氧化碳分压(PaCO_2)、血氧分压(PaO_2)及肺功能。结果治疗前,RSV毛细支气管炎患儿血清中SP-D和IL-4水平明显高于对照组,TGF-β明显低于对照组(P<0.01),且伴随疾病严重程度增加,患儿血清中SP-D和IL-4水平显著升高,TGF-β明显降低(P<0.01)。经Spearman相关性分析,RSV毛细支气管炎患儿血清中SP-D、IL-4水平与PaCO_2呈正相关,与PaO_2呈负相关;而TGF-β与PaCO_2呈负相关,与PaO_2呈正相关(P<0.01)。治疗后,两治疗组潮气量(VT)、达峰时间比(tPTEF/tE)、达峰容积比(VTEF/VE)比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗2组血清中SP-D和IL-4水平明显低于治疗1组,TGF-β显著高于治疗1组(P<0.01)。结论 RSV毛细支气管炎患儿血清中SP-D、TGF-β及IL-4水平与疾病严重程度密切相关,基因重组干扰素γ能下调RSV毛细支气管炎患儿血清中SP-D和IL-4水平及提高TGF-β水平。