刚地弓形虫自噬相关蛋白8(TgAtg8)多克隆抗体制备及初步应用

目的制备、评价特异性抗刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白8(autophagy protein 8,TgAtg8)多克隆抗体。方法生物信息学方法分析弓形虫基因组中自噬相关蛋白的基因序列和氨基酸序列。以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgAtg8编码基因,克隆入pGEX-6p-1载体,构建pGEX-6p-1-TgAtg8重组质粒,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物。以纯化的TgAtg8蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,获得特异性抗TgAtg8多克隆抗体。以制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western blotting分析和间接免疫荧光(IFA)检测。结果双酶切和测序结果证实,原核表达质粒pGEX-6p-1-TgAtg8构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,TgAtg8蛋白在E.coli BL21中获得高效表达,其融合蛋白相对分子质量(Mr)约40 000,与理论值相近。Western blotting结果证实,所制备的多克隆抗体能特异性识别融合蛋白TgAtg8和虫株体内天然的TgAtg8蛋白。IFA实验表明,TgAtg8均匀分布于虫体胞浆中,但在自噬诱导培养后,TgAtg8逐渐聚集成颗粒状。结论制备的特异性抗TgAtg8多克隆抗体可用于检测虫体内TgAtg8蛋白在弓形虫自噬形成过程中的变化情况。

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8(PfAtg8)基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8(PfAtg8)的多克隆抗体,并验证其效价。方法体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^(TM)(DE3)PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行效价验证。结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。

白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。

自噬相关蛋白CfAtg8在果生刺盘孢中的功能分析

油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能尚不清楚。本研究根据同源重组的原理及PEG介导的原生质体转化方法,获得了CfATG8基因敲除突变体及其互补菌株。进一步通过生物学表型分析,发现突变体生长减慢、产孢量减少、附着胞形成率降低、对细胞壁完整性胁迫耐受性降低,并且丧失对油茶的致病性。上述结果表明,CfAtg8参与调控果生刺盘孢的营养生长、无性繁殖、附着胞形成、对外界胁迫应答及致病过程。

CALCOCO1与恶性肿瘤的发生发展

钙结合和螺旋结构域1(CALCOCO1)是近年来新发现的一种自噬调节蛋白,其在选择性自噬中有重要作用。编码基因CALCOCO1位于12q13.13,其编码的CALCOCO1蛋白,通过与ATG8家族蛋白结合,锚定于内质网及高尔基体上,参与内质网及高尔基体自噬,从而参与选择性自噬和早期阶段的自噬体形成。当mTOR通路被激活后,mTOR可通过自噬依赖途径调节CALCOCO1的表达。CALCOCO1在恶性肿瘤的发生、转移及治疗等方面都发挥作用。

细胞自噬相关蛋白在大鼠脾脏撞击伤后12小时内脾组织中的表达

目的观察自噬基因相关蛋白在大鼠脾脏撞击伤后12 h内脾组织内的表达情况。方法选用清洁级健康SD大鼠20只,随机分为正常对照组(A组)、创伤后2 h组(B组)、创伤后8 h组(C组)、创伤后12 h组(D组),每组5只。B、C、D组利用生物撞击机建立脾脏撞击伤模型,A组只麻醉不撞击,麻醉后立即处死取出脾脏,B、C、D组分别于撞击后相应时间取出脾脏,评估脾脏出现损伤的程度。创伤脾组织标本进行HE染色,显微镜下观察受损脾组织的特征。大体标本观察造模是否成功。采用免疫组织化学法及Western blot法检测各组脾组织酵母自噬相关基因Atg6的同源物(Beclin1)、酵母自噬相关基因Atg8的同源物微管相关蛋白1轻链蛋白3(LC3)蛋白的表达。结果 (1)脾撞击伤模型均造模成功。同一撞击力度下不同受伤时间模型组大鼠脾脏裂伤长度和深度基本一致(P均> 0. 05)。(2) HE染色显示模型组脾组织符合脾破裂征象。(3)免疫组织化学法及Western blot法检测显示,模型大鼠随创伤后时间推移(2 h组→8 h组→12 h组),其脾组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达量递升(P均<0. 05),且模型大鼠各时间组均高于对照组(P均<0. 05)。结论脾脏撞击伤可导致脾组织自噬水平的上升;脾脏撞击伤后12 h内脾组织自噬相关蛋白水平随时间的推移,表达逐渐升高。